[发明专利]一种用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂及其制备方法和应用，所述深度共熔溶剂由季铵盐和/或两性离子与氢键供体按终摩尔比(1～3)：(1～9)制成，具有绿色环保、可再生、可重复利用的特点，能够有效破坏霉菌细胞壁，同时有效维持或提高果糖基转移酶的活性和稳定性，促进胞内果糖基转移酶的释放；利用上述深度共熔溶剂提取霉菌胞内果糖基转移酶的方法，提取过程简便、能耗低、条件温和，对黑曲霉菌丝体中的果糖基转移酶的提取效率高，所得果糖基转移酶纯度高、杂蛋白少、酶蛋白活性高、活性损失小。

技术领域

本发明属于酶提取技术领域。具体地，涉及一种用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂及其制备方法和应用。

背景技术

低聚果糖(FOS)是一种天然活性物质，是具有调节肠道菌群、增殖双歧杆菌，促进钙吸收等保健功能的新型甜味剂，被誉为继抗生素时代后最具潜力的新一代添加剂-促生物质。目前，FOS的工业生产可以蔗糖为底物，利用微生物发酵生产的β—果糖基转移酶(β-fructosyltransferase)或β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase)进行分子间果糖基转移反应进行生产。工业上，主要以霉菌发酵生产果糖基转移酶，且果糖基转移酶是霉菌的胞内酶。胞内酶的提取比胞外酶要复杂，且因为霉菌菌丝体细胞壁比较厚，含有几丁质或纤维素的结构，较细菌或酵母强度高，需要采用特殊的设备或特殊的溶剂使细胞破碎，然后才能进行下一步的分离纯化操作以获得有效的酶蛋白，但现有机械破碎或者溶剂破壁效果不好，容易失活。

传统细胞破碎工艺包括机械破碎法、化学法破碎或者酶法破壁。机械破碎法如超声破碎，它是利用超声波在液体中的分散效应，使液体产生空化的作用，从而将液体中的固体颗粒或细胞组织破碎，最终释放酶蛋白。超声波破碎处理量较大，在此过程中会产生热效应、空穴效应、机械效应、热效应，他们对生物大分子蛋白质活性都有一定影响，为避免酶活损失，需要谨慎控制过程条件。此外，超声波破碎法需要特殊的设备、操作复杂、能耗大、所得酶杂质多、酶活性易受影响；化学提取法则因为细胞壁破碎能力有限而提取速度低、效率差，且由于化学试剂或生化试剂的添加容易形成新的污染，给分离纯化增添麻烦；另外，现有技术中，对于霉菌胞内蛋白的提取往往存在能耗高、酶活低，纯化困难、成本高、污染环境的问题。

深度共熔溶剂是一类由氢键受体与氢键供体按一定比例混合而成的室温下为液体的绿色溶剂。所用原料绿色可再生、合成方便、成本低，且其物理化学性质会随着氢键受体与氢键供体种类比例的改变而调整，已广泛用于各种活性物质的提取中，如生物质木质素组分的提取、黄酮类有效物质的提取、花青素的提取等领域。CN105777696A公开了一种利用深度共溶剂提取花青素的方法，具体通过季铵盐与氢键供体按摩尔比1:(10～19)混合，具体地，所述季铵盐为氯化胆碱、四甲基氯化铵、丁基三甲基氯化铵、四乙基氯化铵、三丁基甲基氯化铵、苄基三乙基氯化铵和四丁基氯化铵中的至少一种；所述氢键供体为乙二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇和乳酸中的至少一种。然而，目前尚未见有能够用于提取黑曲霉菌丝体胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂的相关报道。

因此，寻找一种快速、简便、廉价的基于深度共溶剂的胞内果糖基转移酶提取方法具有很高的实用价值。

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂。

本发明的第二个目的是提供上述深度共熔溶剂的制备方法。

本发明第三个目的是提供由上述方法制备得到的深度共熔溶剂在提取霉菌胞内果糖基转移酶中的应用。

本发明第四个目的是提供一种利用深度共熔溶剂提取霉菌胞内果糖基转移酶的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种用于提取霉菌胞内果糖基转移酶的深度共熔溶剂，所述深度共熔溶剂由季铵盐和/或两性离子与氢键供体按终摩尔比(1～3)：(1～9)制成。