[发明专利]用于检测EGFR基因C797S和T790M顺反式突变的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测EGFR基因C797S和T790M顺反式突变的引物、探针及试剂盒。本发明所述的引物、探针组合及试剂盒能够实现基于实时荧光PCR技术平台的EGFR基因C797S和T790M顺式双突变的准确检测，具有检测速度快、易于判读结果、检测试剂成本低、检测灵敏度高、特异性强的优点，同时适用于检测组织样本DNA和血浆游离DNA。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种用于EGFR基因C797S和T790M顺反式突变检测的引物、探针组合及试剂盒。

背景技术

癌症发病率近年来呈逐年上升趋势，我国每年新增癌症患者达350万人以上。肺癌是世界范围内最常见的癌症之一。在我国，肺癌已成为癌症第一位死因，5年生存率约15％。随着肿瘤分子生物学的发展，靶向药物治疗已在临床得到广泛应用，选择合适的患者进行靶向治疗是其成功的关键。

EGFR(表皮生长因子受体，Epidermal Growth Factor Receptor)是目前肺癌靶向治疗的重要靶点。EGFR基因位于人第7号染色体短臂(7p12)，编码跨细胞膜糖蛋白，胞内区具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase，TK)活性，负责将胞外信号传递至胞内。异常的EGFR活化能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移、分化、血管新生，并且能够抑制肿瘤细胞的凋亡。EGFR基因突变主要发生在胞内TK区域的18～21外显子。研究表明：EGFR基因18、19、21外显子发生突变的肺癌患者服用第一代酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors，TKIs)类药物(例如易瑞沙、特罗凯、凯美纳等)的疗效较好，第一代TKIs药物的耐药常与EGFR基因发生的20外显子T790M突变有关。最新上市的第三代TKI(例如泰瑞莎)针对携带T790M突变的肺癌患者仍有效，但在治疗一段时间后可能产生耐药，其中重要耐药机制之一是EGFR基因出现20外显子C797S突变。

当EGFR基因C797S和T790M突变共存，且这两个突变位于相同等位基因上，被称为顺式(in cis)构型；当两者共存但位于不同等位基因上，被称为反式(in trans)构型。最新研究发现，EGFR基因C797S和T790M两种突变共存的不同构型与癌症患者对TKIs药物的耐药性和疗效预测相关。当EGFR基因C797S和T790M为反式突变时，患者接受第一代和第三代EGFR-TKI靶向药物的联合治疗是有效的；当EGFR基因C797S和T790M为顺式突变时，患者对目前所有EGFR-TKI靶向药物均产生耐药。

由此可见，在肺癌患者接受EGFR-TKI靶向药物治疗过程中，应针对携带EGFR基因T790M突变的患者，在用药过程中继续检测C797S的突变状态，尤其是当C797S为阳性时，需要进一步鉴定C797S和T790M发生的是顺式还是反式双突变，从而指导医生制定合理的治疗方案，避免延误患者的最佳治疗时机。

针对晚期肺癌患者，当无法通过活检取组织样本检测时，可通过采集全血、分离血浆中游离DNA来实现基因突变的检测。由于活检组织量很少，血浆游离DNA浓度也很低，其中所含的基因突变比例也可能很低，因此不论针对组织样本还是血浆样本，均要求基因突变检测试剂具有高灵敏度和高特异性。

目前针对EGFR基因C797S和T790M顺反式突变检测方法包括高通量测序(NGS)、数字PCR(dPCR)。NGS方法检测灵敏度可达0.2％，但其检测步骤繁杂、试剂费用昂贵、结果判读依赖于生物信息学分析计算，检测周期长；数字PCR方法检测灵敏度可达0.1％，但其检测步骤较多、试剂费用较实时荧光PCR昂贵很多、结果判读也依赖于专用软件、对阴性/阳性区间的划分主要依赖于针对图形的主观判断。NGS和数字PCR仪器、试剂均很昂贵，因此对操作人员也有很高要求。

鉴于此，目前亟需能够快速、简便、高灵敏度、高特异性、试剂费用低、结果易于判读的检测EGFR基因C797S和T790M顺反式突变的试剂盒。特提出本发明。

发明内容