[发明专利]一种铜绿假单胞菌CRISPRi系统的构建方法

权利要求书

1.一种铜绿假单胞菌CRISPRi系统的构建方法，包括以下步骤：

1)选择并酶切可诱导的穿梭质粒PHERDB20，通过酶切连接法将dCas9基因插入至PHERDB20穿梭质粒中的阿拉伯糖启动子下游，构建PHERDB20-dCas9重组质粒；

2)依据文献报道铜绿假单胞菌的必需基因和/或非必需基因，基于特德原则，为每条基因选取合适的sgRNA序列，通过吉布森克隆法插入步骤1)的PHERDB20-dCas9重组质粒中，构建PHERDB20-dCas9-sgRNA重组质粒，或者以启动子+20nt靶序列+handle结构+终止子直接合成sgRNA的表达序列，通过酶切-连接法，构建PHERDB20-dCas9-sgRNA重组质粒，完成CRISPRi系统的构建；

3)选取不同的必需基因，对构建的CRISPRi系统进行验证，任选的

4)基于构建的CRISPRi系统筛选潜在的抗生素作用靶点。

2.如权利要求1所述的方法，所述sgRNA表达序列，其特征在于:a)所述表达序列的正连上有CCN的序列，b)所述表达序列的序列长度约为20nt，并且靠近ATG区(转录起始密码子)，和c)所述表达序列的序列有特异性。

3.如权利要求1所述的方法，所述铜绿假单胞菌为PAO1菌株。

4.如权利要求3所述的方法，PAO1菌株已确认的必要基因至少有352个。。

5.如权利要求1所述的方法，步骤1)和2)中所述的切酶为为EcoRI/KpnI或XbaI/SalI。

6.如权利要求4所述的方法,将PAO1菌株的必要基因的至少352对gRNA序列引物通过Gibson组装，分别克隆至pHERD20T-dCas9质粒中，构建CRISPRi文库。

7.如权利要求6所述的方法，所述构建的CRISPRi文库为pHERD20T-dCas9-gRNA001至pHERD20T-dCas9-gRNA352。

8.权利要求1或6的方法构建的铜绿假单胞菌CRISPRi系统或文库在寻找治疗铜绿假单胞菌的抗生素靶点的用途。

9.权利要求1或6的方法构建的铜绿假单胞菌CRISPRi系统或文库用于筛选铜绿假单胞菌的必需基因功能的用途。

10.权利要求1或6的方法构建的铜绿假单胞菌CRISPRi系统或文库用于调控和抑制铜绿假单胞菌必需基因表达的用途。