[发明专利]一种对地贫患者的造血干细胞进行基因修正的方法

说明书

本发明公开了一种对地贫患者的造血干细胞进行基因修正的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，在HBB基因‑28(A/G)位点附近选择CRISPR靶点，设计gRNA序列；步骤二，构建一个模版质粒，在HBB基因CRISPR靶点上下游两段500bp序列之间插入piggyBac的双ITRs序列；步骤三，用转染试剂、模版质粒、gRNA和Cas9载体共同转染地贫患者造血干细胞，再对细胞培养基进行嘌呤霉素筛选；步骤四，对抗性基因进行鉴定和验证；本发明将CRISPR/Cas9系统和piggyBac联合使用，可以有效地转染地贫患者的造血干细胞，提高同源重组的效率，有效地对地贫患者的‑28(A/G)突变位点进行修正。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是一种对地贫患者的造血干细胞进行基因修正的方法。

背景技术

β地中海贫血是一种常染色体隐性遗传病。患病原因是HBB(hemoglobin beta)基因的突变，导致β-globin功能不全甚至不表达。该疾病主要分布于地中海区域(从中东到东南亚)，是我国南方各省最常见、危害最大的血液遗传病。-28(A/G)是中国地贫人群中常见的突变位点之一，重症地贫患者β链上两个HBB均有严重的-28(A/G)突变，这些患者会从婴儿期开始表现出严重贫血，生长发育受阻，通常需要定期输血和排铁来维持生命。

目前，同种异体造血干细胞移植(HSCT)是治愈地中海贫血的常用方法，但供体可用性和移植相关风险限制了它的使用。目前，已有研究表明地贫患者通过回输慢病毒基因编辑的造血干细胞后可以完全缓解，无需输血治疗。但是，在其他遗传病的治疗中发现，用病毒载体对宿主基因组进行基因编辑的方式可能会存在脱靶效应，对其他基因造成损伤，存在潜在的风险；市场需要一种可以提高同源重组的效率的基因修正的方法，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种对地贫患者的造血干细胞进行基因修正的方法，本发明将CRISPR/Cas9系统和piggyBac联合使用，可以有效地转染地贫患者的造血干细胞，提高同源重组的效率，有效地对地贫患者的-28(A/G)突变位点进行修正。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种对地贫患者的造血干细胞进行基因修正的方法，包括如下步骤：

步骤一，在HBB基因-28(A/G)位点附近选择CRISPR靶点，设计gRNA序列；

步骤二，构建一个模版质粒，在HBB基因CRISPR靶点上下游两段500bp序列之间插入piggyBac的双ITRs序列；

步骤三，用转染试剂、模版质粒、gRNA和Cas9载体共同转染地贫患者造血干细胞，再对细胞培养基进行嘌呤霉素筛选；

步骤四，对抗性基因进行鉴定和验证。

前述的一种对地贫患者的造血干细胞进行基因修正的方法，

步骤一，在HBB基因-28(A/G)位点附近选择CRISPR靶点，设计gRNA序列；

针对-28(A/G)位点，在HBB基因上设计了3个gRNA序列，每个gRNA包含20bp，紧接着是PAM序列；gRNA的具体序列如下：

gRNA1:GGAGGGCAGGAGCCAGGGCT GGG；

gRNA2:CCAATCTACTCCCAGGAGCA GGG；

gRNA3:AGGGCTGGGCATAAAAGTCA GGG。