[发明专利]一种高效的一步组装多个基因片段的方法

权利要求书

1.一种高效的一步组装多个基因片段的方法，其特征在于，包括overlap PCR—Gibson同源重组步骤，具体步骤如下：

步骤(1)overlap PCR：

第一轮PCR：分别用引物对upper1和lower1、upper2和lower2对目标待融合片段进行PCR扩增，分别将两种产物回收，得到A和B片段；

第二轮PCR：用片段A和片段B作为模板，将片段A和片段B等摩尔数加入，总量不超过100ng，引物只加入upper1和lower2，其他组分不变，首先设置温度梯度摸索合适的退火温度，然后用合适的退火温度进行PCR扩增，电泳观察后测序检测序列是否正确，获得纯的大片段PCR；

步骤(2)Gibson同源重组：通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，这部分对应的退火温度高于48摄氏度，将一个目的基因构建到表达载体上，同时在这个目的蛋白的N端融合上一个大的融合标签，帮助蛋白表达/检测/纯化；

将设计引物扩增出这两个DNA片段，同时这两个DNA片段有各有一部分是同源的，同时这两个DNA片段与载体上各有一部分是同源的；

然后，两个DNA片段进行克隆之后，再进行DNA纯化，最后将线性化的载体片段，这两个DNA片段和Gibson assembly master mix孵育一个小时后直接转化感受态细胞，实现将PCR组装到目标载体。

2.根据权利要求1所述的一种高效的一步组装多个基因片段的方法，其特征在于，步骤(1)中所述第二轮PCR的PCR扩增具体包括以下步骤：

S1变性：设定温度为85℃-95℃，高温使模板片段A和片段B中的双链DNA解离形成单链，解离时间为28s-35s，再将解离后的模板至入浓度为70％的甲酰胺中变性5分钟，温度设定为73℃；

S2退火：设定温度为55℃-60℃，低温下将引物upper1和lower2与模板片段A和片段B互补区结合，退火时间为27s-33s；

S3延伸：设定温度为70℃-73℃，中温下DNA聚合酶催化以模板片段A和片段B为起始点的DNA链延伸反应，延伸时间为35s-65s；

S4：重复S1-S3步骤28-33轮，完成PCR扩增。

3.根据权利要求2所述的一种高效的一步组装多个基因片段的方法，其特征在于，S2退火设定的温度为58℃，且退火时间为32s，S3延伸设定的温度为72℃，且S3延伸时间为40s，S4重复S1-S3步骤的轮数为30轮。

4.根据权利要求1所述的一种高效的一步组装多个基因片段的方法，其特征在于，步骤(1)的第二轮PCR电泳观察测序具体步骤为：

A：称取适量的琼脂糖，放入三角瓶中，加入0.5*TBE，在微波炉上加热，将琼脂糖熔化；

B：然后，待凝胶温度降至55摄氏度以下，加入2-3微升的0.5mg/ml的溴化乙锭，再将移胶板放入胶室中，并将梳子垂直安插在移胶板上方，将熔化的琼脂糖倒入放有移胶板的胶室中；

C：等凝胶完全冷却凝固后变成乳白色不透明状，将梳子垂直拔出，用拇指和指示轻持移胶板两侧，将凝胶体放入加有0.5*TBE电泳缓冲液的电泳槽中，并加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液浸没胶面，高出胶面；

D：取1-2微升上样缓冲液滴在封口膜上，与模板片段A和片段B扩增的PCR样品混合均匀后，一同加入到凝胶孔中，样品沉淀于孔底，再加入模板片段A和片段B扩增的PCR样品；

E：盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压以及电泳方向，打开电源开关，开始电泳，DNA样品从负极向正极移动；

F：最后，前面色素接近胶的先端，切断电流，停止电泳，打开槽盖，取出样品，在紫外灯下观察，摄像，检测序列是否正确。