[发明专利]一种改良大鼠杂交瘤细胞制备的方法

说明书

本发明公开了一种改良大鼠杂交瘤细胞制备的方法，将细胞因子IL6稳定整合到大鼠骨髓瘤细胞IR983F中，制备出IR983F‑IL6细胞，IR983F‑IL6细胞自身可稳定分泌IL6，细胞活力及单个细胞生存能力远高于IR983F，当制备大鼠杂交瘤细胞后，杂交瘤细胞同样拥有IR983F‑IL6的特性，使得在没有饲养细胞的时候，可以轻松获得大鼠杂交瘤细胞；采用重组表达载体免疫动物大鼠；将大鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；筛选获得产生目的蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；该方法可提高杂交瘤细胞活力及存活率，易于大鼠杂交瘤大规模培养制备，在单克隆抗体等蛋白质类生物材料的应用方面，可降低成本和实现规模化生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种改良大鼠杂交瘤细胞制备的方法。

背景技术

淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。利用小鼠杂交瘤细胞制备单克隆抗体应用广泛，但有时因为抗原序列同源性的问题，无法通过免疫小鼠的途径来制备杂交瘤，此时改用大鼠杂交瘤细胞制备单克隆抗体是一种很好的选择。另外，大鼠杂交瘤体系的单克隆抗体产量远大于小鼠杂交瘤体系。同小鼠杂交瘤制备一样，大鼠杂交瘤细胞活力及存活率是一个关键。本方法通过慢病毒介导，将大鼠IL6基因稳定整合到大鼠骨髓瘤细胞IR983F中，通过骨髓瘤细胞稳定分泌表达细胞因子IL6，增强杂交瘤细胞活力及存活率，使得大鼠杂交瘤培养变得简单易行。

中国发明专利CN101307302公开了一种分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞制备工艺，其取含人天冬酰胺羟化酶HAAH编码基因的重组真核表达质粒DNA，注射至小白鼠的骨骼肌进行DNA免疫，1-4周后，进行人天冬酰胺羟化酶HAAH重组蛋白免疫，2-5天后，取免疫小白鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合。进行抗体检测，对抗体检测呈阳性的细胞进行克隆化，至获得可分泌抗人天冬酰胺羟化酶单克隆的杂交瘤细胞株。该发明解决了特异性差、免疫周期长以及效率低的技术问题。该发明免疫原性质明确，纯度高，非特异反应少，抗原用量少，全程免疫仅需6-8周。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改良大鼠杂交瘤细胞制备的方法，采用慢病毒介导将细胞因子IL6基因稳定整合至大鼠骨髓瘤细胞基因组中；将大鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；筛选获得产生目的蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；该方法可提高杂交瘤细胞活力及存活率，易于大鼠杂交瘤大规模培养制备，在单克隆抗体等蛋白质类生物材料的应用方面，可降低成本和实现规模化生产。

本发明具体的技术方案：

一种改良大鼠杂交瘤细胞制备的方法，包括如下步骤：

步骤S1、合成大鼠IL6基因序列，并将其克隆至慢病毒载体pHIV-neo中，构建出一种pHIV-neo-IL6的骨架质粒；

步骤S2、扩增并用无内毒素质粒提取法，提取慢病毒骨架质粒pHIV-neo-IL6和辅助质粒pMD2G、pSPAX2；

步骤S3、采用多质粒共转染法，将3种质粒转染至293T细胞中，48h后收取细胞上清，并从细胞上清中纯化出包装有IL6基因的慢病毒；

步骤S4、用提纯后的慢病毒，感染IR983F细胞，24h后添加G418筛选试剂，之后每48h更换一次含有G418的培养基，两周后含有IL6基因的IR983F细胞存活下来，并形成细胞克隆团，没有整合IL6基因的细胞都将死去；

步骤S5、小心吸取细胞克隆团，并分别转移至24孔板中继续培养，一周后，将细胞活力最强，对G418耐受的细胞进行扩大培养，冻存细胞并命名为IR983F-IL6；