[发明专利]一种依帕司他在制备胰腺癌药物中的应用及对胰腺癌细胞分泌外泌体的抑制作用的验证方法

权利要求书

1.一种依帕司他在制备胰腺癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的一种依帕司他在制备胰腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述胰腺癌药物应用于抑制胰腺癌细胞外泌体的分泌。

3.一种抗胰腺癌的药品组合物，其特征在于，所述药品组合物含有依帕司他。

4.根据权利要求1所述的一种抗胰腺癌的药品组合物，其特征在于，所述药品组合物应用于抑制胰腺癌细胞外泌体的分泌。

5.一种依帕司他对胰腺癌细胞分泌外泌体的抑制作用的验证方法，其特征在于，包括以下过程：(1)建立依帕司他处理后胰腺癌细胞组和对照胰腺癌细胞组，利用低温超速离心法提取细胞上清外泌体；(2)将收集的外泌体裂解后用BCA试剂盒定量蛋白，用测得的蛋白量来反映外泌体的量；(3)透射电镜验证外泌体的双层脂质膜包裹的杯状结构；(4)蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳考马斯亮蓝检测外泌体蛋白浓度。

6.根据权利要求5所述的一种依帕司他对胰腺癌细胞分泌外泌体的抑制作用的验证方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括以下过程：将依帕司他处理后胰腺癌细胞组和对照胰腺癌细胞组在细胞数量相同的标准下留取细胞上清液80ml，在4℃经300×g离心15min，2,000×g离心30min，16,500×g离心30min后去沉淀，所得上清液经过0.22μm滤嘴过滤再150,000×g低温超速离心120min，收集沉淀重悬于100ul PBS中，-80℃分装保存。

7.根据权利要求5所述的一种依帕司他对胰腺癌细胞分泌外泌体的抑制作用的验证方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括以下过程：取10μL收集的外泌体用2.5％的戊二醛固定2h，PBS洗涤外泌体并重悬于100μL PBS中，取20ul滴于小铜片上，3％磷钨酸水溶负染1min，透射电镜观察。

8.根据权利要求5所述的一种依帕司他对胰腺癌细胞分泌外泌体的抑制作用的验证方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下过程：用PBS将蛋白标准溶液稀释到0.5mg/mL；根据样品数量，配制BCA工作液，BCA工作液现配现用，将0.5mg/ml的蛋白标准稀释液按0、1、2、4、8、12、16、20L的顺序加到96孔板中，用PBS补足到20L，稀释后的标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。每孔加1μL外泌体蛋白样品，加PBS补足到20μL。每孔加200μL BCA工作液，37℃孵育20-30min，酶标仪测定562nm的吸光度，根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

9.根据权利要求5所述的一种依帕司他对胰腺癌细胞分泌外泌体的抑制作用的验证方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下过程：制备12％SDS-PAGE凝胶，外泌体中加入5×loading buffer，煮沸20min后上样，电泳结束后，用蒸馏水洗涤凝胶10min，加入适量的考马斯亮蓝快速染色液，在摇床上摇动1h，染色至看到清晰的目标蛋白条带，弃染色液，加适量蒸馏水，拍照观察结果。