[发明专利]一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法及其在治疗视网膜退行性疾病中的应用，该方法为向人羊膜上皮细胞中添加含有10‑100mM烟酰胺和1‑10μM曲古抑菌素A的诱导组合物，诱导产生的细胞高表达MITF、PMEL17、RPE65、Bestrophin等视网膜色素上皮细胞的典型基因。将利用该方法诱导产生的细胞注射到RCS大鼠视网膜下腔，通过ERG以及眼底检测发现大鼠眼睛电生理信号明显增强，眼底结构明显改善，眼球切片HE染色显示其视网膜厚度明显增加，经过上述方案诱导分化后的细胞经注射后对大鼠的视力有一定程度的恢复。本发明中的诱导复合物能够用于人羊膜上皮细胞向视网膜色素上皮细胞的分化以及治疗视网膜损伤相关的眼部疾病。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法及其在治疗视网膜退行性疾病中的应用。

技术背景

视网膜神经退行性疾病目前已经成为世界范围内不可逆致盲的主要原因，影响着数以千万人的视力健康，如视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)、年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration,AMD)及青光眼等。主要表现为视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelial，RPE)细胞及感光细胞(Photoreceptor cell)进行性损伤、丢失而引起视网膜功能障碍，最终导致患者进行性不可逆性视功能下降或丧失，此类疾病至今仍无有效的治疗方法，目前临床上对此缺乏行之有效的治疗手段。但近些年随着技术的发展，基因治疗、干细胞治疗以及人工视觉等方法给上述疾病提供了治疗的可能。

由于眼部较为特殊的生理以及解剖学特点，使其成为上述前沿治疗技术的先行者。首先，由于血-视网膜屏障的存在使眼部成为一个相对独立的器官，外来移植物不容易引起较大的机体免疫反应，存在一定程度的免疫赦免；其次，眼球的体积相对较小，因此治疗所需要的细胞数量比较少；再次，眼球位于身体的浅表层，绝大部分的眼部操作均为可视操作，非常利于相关疗法的进行；另外，眼睛的解剖结构及其生理功能容易观察及分析，可借助裂隙灯显微镜、超声波仪器、眼底照相机、光学相干断层扫描等直接观察眼部各组织的结构，也可应用视觉电生理、眼底荧光照影等技术，实时记录并客观评价视觉功能学改变；最后，两只眼睛可以作为实验的自身对照，便于进行治疗效果的验证。

AMD是一种由遗传、生活方式、环境等多种致病因素导致的视网膜变性疾病，是西方发达国家首要的致盲性眼部。随着我国人口老龄化的加剧和人均寿命的延长，AMD在我国的发病率逐年提高，发病人数越来越多多，严重危害50岁以上人群的视力，是严重危害50岁以上人群视力的致盲性眼病。

AMD主要是由视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)受损和视网膜退行性变引起的一种不可逆性视力下降或丧失的疾病。它发病的部位是在眼底一个特别重要的结构―黄斑。目前市场上用于黄斑病变治疗的抗VEGF制剂有雷珠单抗(Lucentis)、贝伐单抗(Avastin)、阿柏西普(Aflibercept)和康柏西普(Conbercept)，通过结合VEGF抑制血管生成，延缓疾病的进展，但是该类药物并不能根治AMD疾病。

干细胞治疗AMD可能是一个较好的选择。实际上，胚胎干细胞治疗AMD最早可以追溯到2012年，研究者们采用胚胎干细胞分化成RPE移植治疗两人，分别是 AMD以及黄斑失养症，显示出了一定的效果(Akon Higuchi et al.Trends inBiotechnology.2017.)。而到了2017年，与胚胎干细胞类似的诱导多能干细胞(iPS) 也用于AMD的治疗，这项工作发表到了著名医学期刊《新英格兰杂志》上 (Autologous Induced Stem-Cell–Derived RetinalCells for Macular Degeneration.2017.)。但是，胚胎干细胞存在来源受限及伦理等问题，而诱导多能干细胞(iPS)则存在培养技术复杂等问题。

发明内容