[发明专利]一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法及其应用

权利要求书

1.一种诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的方法，所述方法包括如下的步骤：

(1)取人羊膜上皮细胞，在适宜的条件下培养12-48小时；

(2)将细胞培养液换为诱导组合物A继续培养3-14天，诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化，其中所述的诱导组合物A为含有1-10μM SB-431542、1-10μM CKI-7和5-50ng/ml human noggin的细胞培养基；

(3)将细胞培养液换为诱导组合物B继续培养3-10天，诱导人羊膜上皮细胞分化为视网膜感光细胞，其中所述的诱导组合物B为含有5-50ng/ml human noggin、10-100μM牛磺酸和1-10μM维A酸的细胞培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中的细胞培养基为可用于人羊膜上皮细胞培养的培养基，可以自行配置或者直接使用市场上已有的商用培养基。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法中的细胞培养基为DMEM培养基或NPBM培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中的人羊膜上皮细胞为P0或者P1人羊膜上皮细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中的P0或者P1人羊膜上皮细胞按照10⁴-10⁶/孔的细胞量接种于培养容器内培养12-30小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中的P0或者P1人羊膜上皮细胞按照1×10⁵-5×10⁵细胞/孔的细胞量接种于孔板内培养12-24小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中将细胞培养液换为诱导组合物A继续培养5-10天，诱导人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中步骤(2)中诱导组合物A中的细胞培养基为DMEM培养基。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中的诱导组合物A为含有3-7μM SB-431542、3-7μM CKI-7和10-30ng/ml human noggin的细胞培养基。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中中的诱导组合物A通过如下的方法制备：向含有15％KSR(Knockout Serum Replacement)，2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)，1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid)，1mM丙酮酸钠(sodiumpyruvate)，100units/ml penicillin,100μg/ml streptomycin,1％B27 supplement、1％N2 supplement的DMEM/F12 1:1培养基中加入终浓度为1-10μM SB-431542、1-10μM CKI-7和5-50ng/ml human noggin,即得到人羊膜上皮细胞向视网膜感光细胞分化的诱导组合物A。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中将细胞培养液换为诱导组合物B继续培养5-8天，诱导人羊膜上皮细胞分化为视网膜感光细胞。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(3)诱导组合物B中的细胞培养基为DMEM培养基。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中的诱导组合物B为含有10-30ng/ml human noggin、30-50μM牛磺酸和3-7μM维A酸的细胞培养基。