[发明专利]一种环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，取卵清液两次离心分离冻干后分别采用Sephadex G‑50和Sephadex G‑75凝胶洗脱分离纯化得到环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂。本发明得到的环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂采用具有较强的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。

技术领域

本发明涉及一种蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，特别是涉及一种环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化方法。

背景技术

蛋白酶抑制剂是一类多肽或蛋白质，因其能与蛋白酶活性部位结合从而抑制酶的催化活性，可作为蛋白酶的调控物。广泛存在于动植物和微生物体内，与机体内相应的蛋白水解酶形成动态平衡，调节许多重要的生命活动。公开号为CN102372777A的中国专利公开了一种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化方法，方法包括蚕蛹预处理，天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的初步分离纯化，天然丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化的步骤。公开号为CN103044542A的中国专利公开鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂及其基因和应用，从鲫鱼卵中分离纯化得到丝氨酸蛋白酶抑制剂，分子量42651.9Da，等电点5.61，鲫鱼卵丝氨酸蛋白酶抑制剂具有对丝氨酸蛋白酶强烈的抑制活性的特点，且不易产生耐药性，可以为制备肿瘤、胃炎、胰腺炎、癌症等疾病的药物应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，以获得具有宽pH范围稳定性的丝氨酸蛋白酶抑制剂。

本发明技术方案如下：一种环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，包括步骤：环颈雉卵清洗后去壳收集卵清液，混合磷酸氢盐缓冲溶液，用研钵研磨匀浆第一次离心分离取上清液制成冻干粉，将冻干粉溶解于磷酸氢盐缓冲溶液中第二次离心分离取上清液；用磷酸氢盐缓冲溶液平衡Sephadex G-50凝胶过滤柱，取第二次离心分离取上清液上样于处理后的Sephadex G-50凝胶过滤柱，用磷酸氢盐缓冲溶液进行第一次洗脱，使用紫外分光光度计于波长280mm处检测各收集管蛋白含量合并各洗脱峰并冻干；用磷酸氢盐缓冲溶液平衡Sephadex G-75凝胶过滤柱，将前一步骤获得冻干物溶于磷酸氢盐缓冲溶液进行第三次离心取上清液上样于处理后的Sephadex G-75凝胶过滤柱，用磷酸氢盐缓冲溶液进行第二次洗脱，使用紫外分光光度计于波长280mm处检测各收集管蛋白含量合并各洗脱峰并冻干得到环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂，所述磷酸氢盐缓冲溶液浓度为0.1M，pH为6.0。

优选地，所述第一次离心及第二次离心时，转速为12000rpm，在4℃下离心25～30min。

优选地，所述第一次离心时，转速为10000rpm，离心18～20min。

优选地，所述第一次洗脱及第二次洗脱时，洗脱流速为3mL/10min。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

从环颈雉卵清获得的丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较强的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性，在温度在30～80℃时，环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂保持在85％以上，在pH 3～10的范围内抑制剂的活性始终保持在90％以上，环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂的表观分子量分别约为40kDa。

附图说明

图1为环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制剂活性曲线。

图2为环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的时间稳定性曲线。

图3为环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂活性与温度关系示意图。

图4为环颈雉卵清丝氨酸蛋白酶抑制剂活性与pH关系示意图。

具体实施方式