[发明专利]一种产琼胶酶菌株的选育方法

说明书

本发明属于产琼胶酶菌株选育领域，尤其是一种产琼胶酶菌株的选育方法，针对现有的产琼胶酶菌株在琼脂平板上会形成凹陷，同时培养基中的有机营养物含量高，蛋白胨为1％，酵母粉为0.5％，无法纯化产琼胶酶菌株的问题，现提出如下方案，其包括以下步骤：S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、II型培养基、III型培养基，S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，本发明所用培养基为寡营养培养基，有机营养物含量低，能够顺利纯化产琼胶酶菌株，同时能够精准控制人工海水加入量。

技术领域

本发明涉及产琼胶酶菌株选育技术领域，尤其涉及一种产琼胶酶 菌株的选育方法。

背景技术

琼胶是一种亲水性的红藻多糖，琼胶酶能够水解琼胶多糖，因此 琼胶酶在红藻的单细胞分离、酶解破壁制备原生质体等过程中具有重 要的价值，是海藻遗传工程的工具酶。

现有技术中，产琼胶酶菌株在琼脂平板上会形成凹陷，同时培养 基中的有机营养物含量高，蛋白胨为1％，酵母粉为0.5％，无法纯化 产琼胶酶菌株，因此我们提出了一种产琼胶酶菌株的选育方法，用来 解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在产琼胶酶菌株在琼脂 平板上会形成凹陷，同时培养基中的有机营养物含量高，蛋白胨为 1％，酵母粉为0.5％，无法纯化产琼胶酶菌株的缺点，而提出的一种 产琼胶酶菌株的选育方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种产琼胶酶菌株的选育方法，包括以下步骤：

S1：制备三种分离培养基，三种分离培养基分别为I型培养基、 II型培养基、III型培养基，

S2：挑取凹陷中的菌落与1毫升无菌水，混匀，作为种子液；

S3：将种子液梯度稀释，稀释成三种浓度的种子液，然后将三种 浓度的种子液涂布于三种分离培养基上，挑单菌落划线，没能获得纯 种的产琼胶酶菌株；

S4：在制备种子液时添加表面活性剂Tween20，表面活性剂 Tween20的浓度为3％-6％，将种子液涂布于三种分离培养基上，挑单 菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株；

S5：挑单菌落于I型培养基和II型培养基，分别在15℃，28℃， 37℃，45℃的温度条件下培养；

S6：12-24h后，仅在28℃的I型培养基长出了产琼胶酶的菌株， 挑单菌落培养1-2d后，煮沸法提取基因组DNA，并依此为模板PCR扩 增16S rRNA基因片段，与克隆载体连接后，转化大肠杆菌；送测序 公司进行测序；测序成功，获得纯种的产琼胶酶菌株，序列比对结果为：与产琼胶酶菌种Agarivorans litoreus的16S rRNA基因序列相 似性为99.05％。

优选的，所述S1中，称量蛋白胨3-5g，琼脂10-20g，加Na+人 工海水补至1L，即可制得I型培养基。

优选的，所述S1中，称量琼脂10-20g，加Na+人工海水补至1L， 即可制得II型培养基。

优选的，所述S1中，称量蛋白胨1-2g，琼脂10-20g，加Na+人 工海水补至1L，即可制得III型培养基。

优选的，所述S3中，三种浓度的种子液的浓度分别为：10^-1、 10^-2、10^-3。

优选的，所述S4中，在制备种子液时添加表面活性剂Tween20， 表面活性剂Tween20的浓度为6％，将种子液涂布于三种分离培养基 上，挑单菌落划线，仍然没能获得纯种的产琼胶酶菌株。