[发明专利]一种可扩展的合成寡核苷酸肽缀合物的操作方法

说明书

本发明公开一种合成寡核苷酸肽缀合物的方法，其包括以下步骤：a、制备叠氮基寡核苷酸和DBCO‑肽并高度纯化；b、反应准备：将DBCO‑肽溶解在DMSO中得到DBCO‑肽溶液，将叠氮基寡核苷酸溶于水或水与DMSO的混合液中得到叠氮基寡核苷酸溶液；c、偶联反应：先对叠氮基寡核苷酸进行高效液相色谱分析，再确定缀合物峰的位置，对反应产物提取样品并进行高效液相色谱分析，确定偶联反应之后反应产物的峰的位置，未反应的叠氮基寡核苷酸的峰的面积，之后进行逐步叠加反应。本发明适合大规模生产、无需进一步纯化、成本低、避免产物降解。

技术领域

本发明涉及有机化学、生物化学、分子生物学技术领域，尤其涉及一种可扩展的合成寡核苷酸肽缀合物的操作方法。

背景技术

寡核苷酸肽缀合物（Peptide–oligonucleotide conjugates， OPCs）因其同时具备寡核苷酸和多肽的结构与活性而具有其独特的性质，广泛运用于从纳米技术到药物传递和反义技术等各个领域。

多肽能识别蛋白的特殊位点，对细胞有穿透性，这样的特性与寡核苷酸的碱基对识别能力的结合，使得OPCs分子能有广泛的应用(Leonetti,Degols et al.,1990；Soukchareun,Tregear et al.,1995)。OPCs最初被用于反义技术，即通过将一个小的DNA序列杂交到mRNA区域使其编码出想要的基因片段。OPCs非常适合用于这一类型的研究，因为OPCs分子上结合的多肽能够识别特定的细胞类型，并能将寡核苷酸进行跨膜转运，使其能选择性地在细胞内与mRNA杂交从而抑制其翻译。

自最初OPCs分子被作为反义试剂以来，又出现了很多新的应用，已扩展至生物纳米技术。其中一类工作是在结构DNA纳米技术的进步上，该技术利用OPCs分子的核酸部分将单个多肽引导到DNA纳米结构表面的特定位置。比如，c-myc多肽能与一条长度为二十个碱基的短单链DNA分子偶联，所得到的缀合分子与二维DNA纳米阵列表面的DNA探针序列互补(Williams,Lund et al.,2007)。杂交完成后，铺瓦式阵列产生一个纳米级的均匀间隔64纳米的平行线图案，当用同源性的anti-c-mys抗体进行探测时，抗体能够特异性地识别出在纳米阵列表面地c-myc肽。这种在DNA纳米结构表面显示肽的技术被称为纳米显示。另外一个例子是在DNA纳米管上陈列的OPCs被用作模板，使得DNA纳米管地表面均匀分布纳米金颗粒(Williams,Lund et al.,2007)。总之，这两个例子证明OPCs分子可以在纳米层面上精确的编码生物材料和无机材料。

目前已有几种不同的生产OPCs分子的方法被报道(Roberts and Szostak,1997；Venkatesan and Kim,2006；Moroder,Steger et al.,2009)，其中大多数都涉及线性固相合成步骤，即，将多肽和寡核苷酸直接在固相载体上连续偶联合成(Grandas,Marchan etal., 2007)。多肽序列首先链接到固相载体上，于C端基团上修饰一个羟基， 再通过磷酸二酯键偶联第一个核甘单体，然后依次合成余下的寡核苷酸序列。连续合成法需要根据多肽合成仪肽和寡核苷酸合成仪的特点来具体设计，涉及的化学保护基团也必须同时兼容多肽和寡核苷酸的固相化学方法(Venkatesan and Kim,2006)。

还有片段偶联法，它是比线性的连续合成法更便捷的一种方法。在分别合成多肽和寡核苷酸以后，将两个分子通过共价化学键链接起来成为一个OPCs分子，而且共价链接基团在化学结构和性质上可以有多种选择，目前一般是通过点击化学方法生成，比如巯基和马来酰亚胺的加成反应，炔基和叠氮基的加成反应。