[发明专利]一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法

说明书

本发明涉及中药材种植技术领域，特别涉及一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法。该方法具体包括如下步骤：（1）卫矛种子外植体的采集；（2）种子前处理；（3）种子消毒；（4）种子萌发诱导；（5）胚状体诱导。采用本发明方法，不仅能有效抑制卫矛种子内生菌的生长，而且能显著提高卫矛种子萌发率和胚状体诱导率。具体表现为：卫矛种子内生菌污染率降低至8%以下，种子萌发率从不足10%提高到90%以上，胚状体诱导率达88%以上，对于实现卫矛的规模化种子繁殖和组织培养的开展具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法。

背景技术

卫矛（Euonymus alatus）又名鬼箭羽，是卫矛科卫矛属植物。卫矛种子为贵州的一种名贵苗药药材，具有解毒消肿、破血通经、杀虫之功效，还可以用于治疗产后淤血腹痛、月经不调、糖尿病、跌打损伤肿痛等症。但目前，卫矛种子存在萌发率低、活力低等问题，而现有的研究仅限于卫矛化学成分及药理作用以及部分组织培养等方面，其中并未涉及卫矛种子内生菌抑制、胚状体诱导等过程的研究。

卫矛的繁殖方法包括播种和嫁接。播种方法为：秋天果实成熟后采收，待果皮开裂后收集种子并晾干、收藏。翌年一月将种子用30℃温水浸种24小时，然后于湿沙背阴处贮藏。3月下旬移至背风向阳处并保持20~25℃催芽，待胚根出现后即可播种。采取条播，株距3~5 cm，行距35 cm，覆土厚度2~3 cm，播种量10 kg/亩。嫁接方法为可用丝棉木作砧木，3月中下旬砧木萌动时即可嫁接，采用劈接和切接方法进行，有很高的观赏价值。

卫矛种子在自然条件下萌发率极低，常规播种试验证明其萌发率几乎为零，而经过一定浓度的赤霉素、细胞分裂素等激素处理之后，萌发率依然不足10%。由于种子萌发条件的限制，现在卫矛快繁技术多是以带芽茎段作为外植体，但是组培苗生长缓慢，炼苗不易成活。目前，园林上多采用丝棉木作为砧木进行嫁接繁殖，虽然可以实现卫矛的规模化繁殖，但嫁接属于无性繁殖，无法实现卫矛的基因重组和品种改良及杂交优势的利用。因此，只有实现卫矛的种子顺利成苗，才能实现亲本到子代的延续，杂交培育新品种才具有可行性，突破卫矛种子的萌发技术，对于实现该品种的种质保存和品种改良具有非常重要的意义。因此，提供一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明提供了一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法。采用本发明方法能将卫矛种子作为外植体培养胚状体过程中内生菌污染率降低至8%以下，提高卫矛种子萌发率达90%以上，胚状体的诱导率达88%以上，对于实现卫矛的再生植株诱导及组织培养快繁体系的建立具有非常重要的作用。本发明提出的消毒方法和接种方法，操作简单，且解决了卫矛种子组织培养过程中内生菌污染这一难题，大大降低了污染率，极大的促进了卫矛种子的萌发和胚状体的培养。本发明为卫矛实生苗育苗，为分子育种的愈伤诱导及再生体系的建立等奠定技术基础，同时也提高卫矛种子的萌发率及利用率，从源头上解决市场苗木及资源紧缺等问题。

本发明可通过以下技术步骤实现：

1）种子采集

于8～10月份，待卫矛种子成熟（外层绿色果皮裂开，露出里面红色假种皮）后，于晴天的上午10：00后采收种子。种子采收时，应连果蒂一起摘下，摘下后放入干净的泡沫冰盒中带回实验室备用。

2）种子前处理：种子摘下当天，取出卫矛种子，剥去外面的种皮和假种皮，放入洁净的烧杯中，用流水冲洗干净，然后用150~200 mg/L的赤霉素GA₃浸泡28~36 h，其中前14~18 h放置于4℃冰箱中，后14~18 h放置于25~30℃恒温箱中。优选的，赤霉素GA₃的浓度为180 mg/L，先于4℃冰箱中放置16 h，后于25~30℃恒温箱中放置16 h。