[发明专利]一种干细胞体外诱导培育心肌细胞的方法

权利要求书

1.一种干细胞体外诱导培育心肌细胞的方法，其特征在于，S11.取自体干细胞制成单细胞悬液；S12.将单细胞悬液细胞计数后用分化培养基将其稀释成细胞浓度为10^-5~10^-3cells/mL的干细胞悬液，接种于细菌培养皿的盖子内表面上，翻转培养皿盖子，使盖子上的干细胞形成悬滴，培养皿中加入水或水溶液以保持悬滴在孵育过程中的湿度，培养皿置于5%CO₂、37℃培养箱中培养1~3天；S13.收集培养皿盖子上悬滴中形成的拟胚体，将其转移到盛有分化培养基的细菌培养皿中，放入培养箱中继续悬浮，促使拟胚体进一步增殖；S14.将制备好的拟胚体转移到明胶包被的孔板，每孔一个拟胚体添加诱导分化培养基，进行干预分化培养；所述诱导分化培养基中包括丹酚酸B 0.7~1.2mg/L、人参皂苷0.5~1.5mg/mL、淫羊藿苷0.8~1.2mg/L；

所述人参皂苷的50%~60%制成微胶囊，将含有人参皂苷的微胶囊添加到培养基中，所述含有人参皂苷的微胶囊的制备方法为：S31. 将谷胱甘肽、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、去离子水按1:1:100~120，制得混合溶液，在混合溶液中加入pH=6的磷酸盐缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液中分散有改性纳米四氧化三铁颗粒，所述改性纳米四氧化三铁同磷酸盐缓冲溶液的质量比为1:600，所述改性纳米四氧化三铁分散到磷酸盐缓冲溶液中的方式为超声分散；无氧条件下搅拌24h，反复吸附、洗涤，得到壁材，所述混合溶液同磷酸盐缓冲溶液的体积比为1:6~8；S32.将人参皂苷分散于羟基硅油中，所述人参皂苷同羟基硅油的比例为1:100~120，得到芯材；S33.按体积比1:5的比例将壁材和芯材混合，在冰水浴下使用超声探头对油水两相界面进行超声5~10min，对产物进行多次吸附、洗涤，得到微胶囊；

所述人参皂苷的制备方法为：S41.将纤维素酶、果胶酶加入到去离子水中，同切成薄片的人参混合，45℃下反应1h，得到酶解提取液；S42.向酶解提取液中第一次加入95%的乙醇，55℃回流3h，过滤，得到初提液和残渣，残渣第二次加入95%的乙醇进行提取，55℃回流2h，同初提液合并，得到醇提液，所述第一次乙醇加入量：第二次乙醇加入量=1:4；S43.将醇提液在50℃减压浓缩成浸膏状，在浓缩过程中回收乙醇，得到的浸膏真空干燥既得人参皂苷；

所述改性纳米四氧化三铁的改性方法为：将纳米四氧化三铁分散在的去离子水中，加入纳米层状双氢氧化物，超声分散后干燥，得到纳米层状氢氧化物改性的纳米四氧化三铁，所述纳米四氧化三体：纳米层状氢氧化物：去离子水=1:0.2~0.5：20；

所述纳米层状氢氧化物的制造方法为：将硝酸铝和硝酸铝溶于去离子水后，加入到剧烈搅拌的1.25%的氢氧化钠溶液中，进行水热反应，反应产物干燥后粉碎得到纳米层状氢氧化物；所述硝酸铝：硝酸镁：去离子水=1:0.75:30。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞体外诱导培育心肌细胞的方法，其特征在于，所述诱导分化培养基中还包括GMEM培养基、胎牛血清、非必需氨基酸、50mmol/L的丙酮酸钠水溶液和0.1mol/L的二巯基乙醇水溶液，所述GMEM培养基：胎牛血清：非必需氨基酸：50mmol/L的丙酮酸钠水溶液：0.1mol/L的二巯基乙醇水溶液=73.5:24:1:1.3:0.2。

3.根据权利要求1所述的一种干细胞体外诱导培育心肌细胞的方法，其特征在于，所述纤维素酶、果胶酶、去离子水、人参的质量比为5×10^-4 :10^-3 :1:4。

4.根据权利要求1所述的一种干细胞体外诱导培育心肌细胞的方法，其特征在于，所述乙醇同酶解提取液的质量比为1:0.4。

5.根据权利要求1所述的一种干细胞体外诱导培育心肌细胞的方法，其特征在于，所述水热反应的条件为：在80~120℃下反应48h。