[发明专利]12-羟基胆酸脱氢酶及其应用

说明书

本发明公开了一种来源于Eggerthella lenta的新型12‑羟基胆酸脱氢酶及其编码基因，并利用该酶作为生物催化剂催化胆酸及其衍生物12‑羟基氧化为羰基底物。编码该酶的基因与目前已知的12‑羟基甾体脱氢酶同源性低，对12‑羟基胆酸及其衍生物酶活高，并且在培养表达该基因的大肠杆菌过程中，不需要加入抗生素，不利用传统的异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，就可以实现高效的表达。在转化过程中，通过浓缩菌体后，底物浓度可以达到200克/升，以95％的转化率实现，并且反应过程中不使用任何有机溶剂，转化方法绿色、环保。

技术领域

本发明涉及来自Eggerthella lenta的12-羟基胆酸脱氢酶、编码该酶的序列、获得该酶的方法，以及在氧化胆酸及其衍生物中12-位羟基的方法。

背景技术

熊去氧胆酸可以用于治疗脂肪肝合并高脂血症(熊去氧胆酸联合来适可治疗脂肪肝合并高脂血症患者的效果，魏鸿，2017，30,133)，熊去氧胆酸单药治疗原发性胆汁性肝硬化肝炎。目前的合成熊去氧胆酸的方法多为利用胆酸为底物通过化学氧化-还原的方法获得，仅近年来生物催化的发展使得酶催化在熊去氧胆酸中有了广泛的应用 (The enzymicand chemical synthesis of ursodeoxycholic and chenodeoxycholic acid fromcholic acid,Sutherland,J.D.Macdonald,I.A.Forrest,T.P.Prep.Biochem.,1982,12,307-321；)。

目前生物法参与的熊去氧胆酸的合成中(式1)，主要研究重点在于如何以胆酸为底物区域选择性的氧化12α-OH以及7α-OH，酶法表现出了优异的结果(One-step synthesisof 12-ketoursodeoxycholic acid from dehydrocholic acid using a multienzymaticsystem,Liu,L.Braun,M.Gebhardt,G.Weuster-Botz,D.Gross,R.Schmid,R.D.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2013,97,633-639；Multi-enzymatic one-pot reduction ofdehydrocholic acid to 12-keto-ursodeoxycholic acid with whole-cellbiocatalysts,Sun,B. Kantzow,C.Bresch,S.Castiglione,K.Weuster-Botz,D.Biotechnol.Bioeng.,2013,110, 68-77)。目前的工业生产中利用较为廉价易得的胆酸为底物合成熊去氧胆酸。通过7，12位羟基的区域选择性氧化及随后还原7-位羰基为β羟基，利用黄鸣龙还原12-羰基的方法制备熊去氧胆酸。

目前利用化学法实现利用胆酸为底物氧化时，由于氧化剂缺少区域选择性，往往会有3-羰基的副产物生成。酶法实现胆酸的12-氧化能够区域选择性的专一氧化12- 羟基，如来源于Clostridium sp.的12-羟基甾体脱氢酶可以专一性实现胆酸12位羟基的氧化，该酶的辅酶专一性是NADPH(12α-Hydroxysteroid dehydrogenase from Clostridium groupP,strain C 48-50 Production,purification and characterization，Manfred Braun,Heinrich Lunsdorf,Andreas F.Buckmann,Eur.J.Biochem,1991,196,439-450)。截止到目前，尚未有天然NAD(H)依赖的12-羟基甾体脱氢酶序列报道，由于在反应过程中，往往需要加入辅因子NAD(P)⁺提高反应速率从而达到提高底物浓度的目的，但是NADP⁺的价格是NAD⁺的五倍左右，因此NAD(H)依赖的12-羟基甾体脱氢酶的发现和使用，可以明显降低反应中辅因子的成本，考虑到目前的国内对环境问题的密切关注，人民群众对环保问题的认识提高，因此能够获得建立高底物浓度高转化率的绿色催化工艺是非常必须的。