[发明专利]基因组靶向修饰方法

权利要求书

1.一种基因组靶向修饰的方法，其包括如下步骤：

(1)在待修饰基因的选定位置处制造双链缺口，其中所述选定位置位于待修饰基因的内含子中；

(2)将核酸构建体连接入所述双链缺口中；

其中所述核酸构建体包含串联的元件1和元件2，其中元件1包含可条件性移除的待修饰基因选定位置后的剩余编码序列C1，从而保证待修饰基因的正常表达；

所述元件2包含表达终止信号，其能够在元件1中所述的剩余编码序列C1被移除后，终止待修饰基因的转录和/或翻译，从而缺失待修饰基因的内源表达。

(3)任选的，移除元件1中的所述剩余编码序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中元件1包含位点特异性重组酶的识别位点S1、所述选定位置之后的第一个剪接位点以及选定位置之后所述待修饰基因的剩余编码序列C1、以及位点特异性重组酶的识别位点S2，其中所述S1和S2能够在位点特异性重组酶的作用下使两位点之间的序列被缺失。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中元件2包含1-50个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个串联的转录终止信号(TTS)，和/或翻译终止信号；例如，所述转录终止信号可以是SV40polyA和/或BGH polyA等。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(3)包括如下步骤：将能够识别所述识别位点S1和/或S2的位点特异性重组酶与已连接入所述双链缺口中的所述核酸构建体接触。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤(1)中所述选定位置是ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系统的识别位点，具体的，步骤(1)包括下列步骤：将包含待修饰基因的基因组与ZFN、TALEN或Cas以及辅助核酸序列接触，优选的，所述选定位置是CRISPR/Cas(例如CRISPR/Cas9或Cas9/gRNA)的识别位点，所述辅助核酸序列为单链向导RNA(sgRNA)，或者crRNA(CRISPR-derived RNA)与tracrRNA(trans-activating RNA)形成的tracrRNA/crRNA核酸复合物。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(2)中所述连接是非同源末端连接(NHEJ)。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述翻译终止信号是一段包含终止密码子的核酸序列，优选是一段包含有所述选定位置之后第一个剪接位点以及所述选定位置之后第一个外显子全长或者部分序列的核酸序列，其中在所述外显子的全长或部分序列中，通过插入、缺失或者点突变的方法引入终止密码子。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(2)中所述核酸构建体位于载体中，所述载体优选为质粒载体，优选的，所述质粒载体为线性化的质粒载体。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述线性化是体内线性化或者体外线性化。

10.根据权利要求9所述的方法，所述体内线性化包括如下步骤：在所述载体的所述核酸构建体上游引入能够被切割的位点，将载体引入细胞内，将载体与能够识别所述切割位点的酶和/或辅助核酸序列接触。

优选的，所述能够被切割的位点是ZFN、TALEN或CRISPR/Cas的识别位点，并且所述识别位点的序列不存在于所述细胞的基因组中，相应的，所述酶分别为ZFN、TALEN或Cas，例如，所述Cas优选为Cas9，所述位点是CRISPR/Cas9的识别位点，优选的，所述CRISPR/Cas9的识别位点是hEMX1位点，序列优选为GTCACCTCCAATGACTAGGGTGG，或者lamGolden位点，序列优选为GGGTCAACGACTTCCTGCACGGG。