[发明专利]一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌四联灭活疫苗及其应用

权利要求书

1.一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌四联灭活疫苗，其特征在于：包括灭活的猪肺炎支原体菌株HNMhy1血清型抗原、灭活的副猪嗜血杆菌菌株HNHPS1血清型抗原、灭活的副猪嗜血杆菌菌株HN1570血清型抗原、灭活的猪链球菌菌株HNSS1血清型抗原、灭活的胸膜肺炎放线杆菌菌株HNAPP1血清型抗原；

其中：菌株HNMhy1为猪肺炎支原体，于2017年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：13858；菌株HNHPS1为血清4型副猪嗜血杆菌Haemophilus parasuis，于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：13335；菌株HN1570为血清5型副猪嗜血杆菌Haemophilus parasuis，于2018年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：16802；菌株HNSS1为2型猪链球菌Streptococcus suis，于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：13334；菌株HNAPP1为1型胸膜肺炎放线杆菌Actinobacilus pleuropneumoniae, 于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：13333。

2.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌四联灭活疫苗，其特征在于：所述灭活的猪肺炎支原体菌株HNMhy1血清型抗原、灭活的副猪嗜血杆菌菌株HNHPS1血清型抗原、灭活的副猪嗜血杆菌菌株HN1570血清型抗原、灭活的猪链球菌菌株HNSS1血清型抗原和灭活的胸膜肺炎放线杆菌菌株HNAPP1血清型抗原的比例为1∶1∶1∶1∶1。

3.一种如权利要求1所述的猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌四联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

增殖：将猪肺炎支原体HNMhy1株、副猪嗜血杆菌4型HNHPS1株、副猪嗜血杆菌5型HN1570株、猪链球菌2型HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌1型HNAPP1株分别繁殖培养，获得猪肺炎支原体HNMhy1株、副猪嗜血杆菌HNHPS1株、副猪嗜血杆菌HN1570株、猪链球菌HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌HNAPP1株菌液，并分别进行活菌计数；

灭活：分别向步骤a中获得的猪肺炎支原体HNMhy1株、副猪嗜血杆菌HNHPS1株、副猪嗜血杆菌HN1570株、猪链球菌HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌HNAPP1株菌液中按照菌液体积的0.2%加入甲醛溶液，于37℃灭活24h；

浓缩：使用超滤装置分别浓缩灭活后检验合格的猪肺炎支原体HNMhy1株、副猪嗜血杆菌HNHPS1株、副猪嗜血杆菌HN1570株、猪链球菌HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌HNAPP1株菌液，根据灭活前的活菌计数，用无菌生理盐水调整浓缩终浓度为1.0×10¹⁰ CFU/mL；

制备疫苗：

（1）油相的制备：按体积比取注射用白油92份加入油相罐内，向罐内加入硬脂酸铝1份，边加边搅拌直至完全透明，再加入司本-80 6份，116℃高压灭菌40min，冷却至室温后再加入维生素A和维生素E各0.5份，混合均匀使维生素A和维生素E的浓度均为300IU/Ml，得到油相备用；

（2）水相的制备：将浓缩后获得的猪肺炎支原体HNMhy1株、副猪嗜血杆菌HNHPS1株、HN1570株、猪链球菌HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌HNAPP1株抗原液，按照1∶1∶1∶1∶1的比例混匀配制成抗原液，按体积份比取95份的抗原液，加入灭菌后的吐温-80 5份，充分搅拌直至完全溶解，得到水相备用；

（3）乳化：按照水相和油相1:2的比例，先向乳化罐内加入油相，以3000-4000rpm的转速搅拌，再向乳化罐中加入水相继续搅拌混合乳化，乳化完成后分装装瓶。

4.根据权利要求3所述的一种猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌四联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤a中繁殖培养的操作步骤为：

（1）一级种子繁殖：将猪肺炎支原体HNMhy1株接种到PPLO固体培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，副猪嗜血杆菌4型HNHPS1株、5型HN1570株、猪链球菌2型HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌1型HNAPP1株冻干菌种分别接种于TSA平板上，37℃培养18~24小时，挑取符合要求的典型菌落，分别传代接种于TSA平板上，于37℃培养24小时，检验合格后，作为一级种子；所述TSA平板中添加有终浓度5％的新生牛血清和终浓度0.01%的NAD；

（2）二级种子繁殖：将猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌4型HNHPS1株、副猪嗜血杆菌5型HN1570株、猪链球菌2型HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌1型HNAPP1株一级种子分别接种到PPLO、TSB液体培养基中，于37℃，5%CO₂摇床振荡分别培养3d、18~24小时，进行纯粹检验合格后，作为二级种子；所述TSB液体培养基中添加有终浓度5％的新生牛血清和终浓度0.01%的NAD；

（3）将猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌4型HNHPS1株、5型HN1570株、猪链球菌2型HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌1型HNAPP1株菌株的二级种子按1％分别接种于PPLO和TSB液体培养基中，分别于37℃，5%CO₂摇床振荡分别培养3d、18～24小时后收获菌液；所述TSB液体培养基中添加有终浓度5％的新生牛血清和终浓度0.01%的NAD。