[发明专利]一种副猪嗜血杆菌、猪链球菌与胸膜肺炎放线杆菌三联灭活疫苗及其应用

权利要求书

1.一种副猪嗜血杆菌、猪链球菌与胸膜肺炎放线杆菌三联灭活疫苗，其特征在于：包括灭活的副猪嗜血杆菌菌株HNHPS1血清型抗原、灭活的副猪嗜血杆菌菌株HN1570血清型抗原、灭活的猪链球菌菌株HNSS1血清型抗原、灭活的胸膜肺炎放线杆菌菌株HNAPP1抗原。

2.根据权利要求1所述的一种副猪嗜血杆菌、猪链球菌与胸膜肺炎放线杆菌三联灭活疫苗，其特征在于：所述菌株HNHPS1为血清4型副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis），于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：13335；所述菌株HN1570为血清5型副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis），于2018年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：16802；所述菌株HNSS1为2型猪链球菌（Streptococcus suis），于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：13334；所述菌株HNAPP1为1型胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilus pleuropneumoniae）, 于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：13333。

3.根据权利要求1所述的一种副猪嗜血杆菌、猪链球菌与胸膜肺炎放线杆菌三联灭活疫苗，其特征在于：所述菌株HNHPS1血清型抗原、菌株HN1570血清型抗原、菌株HNSS1血清型抗原、菌株HNAPP1抗原的比例为1∶1∶1∶1。

4.一种副猪嗜血杆菌、猪链球菌与胸膜肺炎放线杆菌三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.增殖：将副猪嗜血杆菌4型HNHPS1株、5型HN1570株、猪链球菌2型HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌1型HNAPP1株分别繁殖培养，获得副猪嗜血杆菌HNHPS1株、HN1570株、猪链球菌HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌HNAPP1株菌液，并分别进行活菌计数；

b.灭活：分别向步骤a中获得的副猪嗜血杆菌HNHPS1株、HN1570株、猪链球菌HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌HNAPP1株菌液中按照菌液体积的0.2%加入甲醛溶液，于37℃灭活24h；

c.浓缩：使用超滤装置分别浓缩灭活后检验合格的副猪嗜血杆菌HNHPS1株、HN1570株、猪链球菌HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌HNAPP1株菌液，根据灭活前的活菌计数，用无菌生理盐水调整浓缩终浓度为1.0×10¹⁰ CFU/mL；

d.制备疫苗：包括以下步骤

（1）油相的制备：按体积比取注射用白油92份加入油相罐内，向罐内加入硬脂酸铝1份，边加边搅拌直至完全透明，再加入司本-80 6份，116℃高压灭菌40min，冷却至室温后再加入维生素A和维生素E各0.5份，混合均匀得到油相备用；

（2）水相的制备：将浓缩后获得的副猪嗜血杆菌HNHPS1株、HN1570株、猪链球菌HNSS1株和胸膜肺炎放线杆菌HNAPP1株抗原液，按照1∶1∶1∶1的比例混匀配制成抗原液，按体积份比取95份的抗原液，加入灭菌后的吐温-80 5份，充分搅拌直至完全溶解，得到水相备用；

（3）乳化：按照水相和油相1∶2的比例，先向乳化罐内加入油相，以3000-4000rpm的转速搅拌，再向乳化罐中加入水相继续搅拌混合乳化，乳化完成后分装装瓶。