[发明专利]利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一株利用甘油生产γ‑氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法。首先通过对甘油促进蛋白基因glpF，甘油脱氢酶基因dhaD和二羟丙酮激酶基因dhaK进行RBS随机突变，获得可以高效利用甘油的谷氨酸棒杆菌突变菌株。通过过表达巨大芽孢杆菌中的谷氨酸脱羧酶基因gad获得可以利用甘油生产γ‑氨基丁酸的底盘菌株。通过利用不同强度RBS来表达谷氨酸脱羧酶，高强度RBS最有利于γ‑氨基丁酸合成；然后通过提高前体物L‑谷氨酸的水平，再通过对γ‑氨基丁酸的降解途径进行敲除，对γ‑氨基丁酸的转运蛋白基因gadC进行过表达。最终以60g/L的甘油为底物，经过84h发酵，γ‑氨基丁酸含量达到10.94g/L。

技术领域

本发明属于合成生物学和代谢工程技术领域，以食品安全级微生物谷氨酸棒杆菌为宿主菌，通过代谢工程策略构建一株可以利用甘油生产γ-氨基丁酸的菌株。

背景技术

γ-氨基丁酸广泛存在于植物、微生物和动物中，目前已经广泛应用于饲料、食品、保健品和工业等领域。通过化学法合成GABA会有部分化学试剂残留，安全性差，不利于在食品及医药行业使用，微生物发酵法条件温和，操作简单，污染小，有利于工业化生产，可以通过微生物细胞中的GAD把L-谷氨酸转化为GABA。

谷氨酸棒杆菌是短小棒状，单个或八字排列的革兰氏阳性菌，是产生异源蛋白质的有效宿主。谷氨酸棒状杆菌是食品安全级菌株，工业领域常用于产氨基酸类、核酸类和有机酸类产品，也可用于生产食品添加剂或医药原料。

近年来，由于生物柴油的需求量不断增长，其副产物甘油达到生物柴油的10％，甘油产量随之也出现了供大于求的现在，所以把甘油转化为高价值产品成为当今研究热点。目前有研究表明可以将甘油转化为丁二醇、琥珀酸、富马酸等，但转化为GABA的研究仅有一项。相关研究在大肠杆菌中开展，但是由于产量较低且需要外源添加L-谷氨酸，无法满足实际生产需求。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一株利用甘油生产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法。主要步骤如下：

(1)本发明选择食品安全微生物谷氨酸棒杆菌为宿主菌株。

(2)本发明首先通过对甘油转运蛋白基因glpF、甘油脱氢酶基因dhaD和二羟丙酮激酶基因dhaK进行RBS随机突变，提高了菌株对甘油的利用效率。

(3)在(2)获得的菌株的基础上，通过过表达巨大芽孢杆菌中的谷氨酸脱羧酶基因gad，获得可以从甘油生产γ-氨基丁酸的菌株。

(4)在(3)获得的菌株的基础上，比较不同强度RBS来表达gad对γ-氨基丁酸产量的影响，获得最适合γ-氨基丁酸合成的谷氨酸脱羧酶(GAD)活性。

(5)在(4)获得的菌株的基础上，通过敲除丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶基因pknG，过表达自身的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，并对基因ppc的表达强度进行调整，促进前体物L-谷氨酸的积累。

(6)在(5)获得的菌株的基础上，通过敲除γ-氨基丁酸氨基转移酶基因gabT，琥珀酸-半醛脱氢酶基因gabD，γ-氨基丁酸逆向转运蛋白基因gabP，从而减少γ-氨基丁酸的降解。

(7)在(6)获得的菌株的基础上，通过过表达谷氨酸/γ-氨基丁酸转运蛋白基因gadC，促进γ-氨基丁酸的转运能力。