[发明专利]水解酶基因ameH及其编码的蛋白和应用

说明书

本发明公开了水解酶基因ameH及其编码的蛋白和应用。本发明水解酶基因ameH全长为951bp，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物水解酶AmeH含316个氨基酸，序列为SEQ ID NO.2。AmeH能降解灭多威杀虫剂。水解酶AmeH可用于降解土壤、水体中灭多威的残留，具有非常重要的理论和应用价值。

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及水解酶基因ameH及其编码的蛋白和应用，具体涉及降解肟类氨基甲酸酯类农药——灭多威的水解酶基因ameH和其应用。

背景技术

氨基甲酸酯类农药是与有机磷、拟除虫菊酯并驾齐驱的三大农药之一的一类新型广谱杀虫、杀螨和除草剂。因有机氯农药的禁用、限用，及抵抗有机磷农药的昆虫种类逐渐增加，氨基甲酸酯类农药的使用量也随之越来越大。灭多威是一种广泛用于农林业的氨基甲酸酯类农药，除了常见的灭多威剂型作为农药使用外，还可以与其他多种杀虫、杀螨剂结合配制成复配剂，如与毒死蜱、阿维菌素、哒螨灵、辛硫磷、氧乐果、吡虫啉、高效氯氰菊酯等。在棉花、桑茶、果蔬等作物中可以通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)而防治双鳞翅目、鳞翅目、丰翅目等120多种害虫，且是目前防治抗药性棉蚜良好的替换品种。我国是农药生产和使用大国，占杀虫剂生产总量20％的高毒农药仍有灭多威，且在市场上依旧活跃。灭多威作为农民常规当家农药，近年产量稳定。20世纪90年代中期全球销售额最大的44个农药品种中，灭多威为其中一员。因此从使用情况来看，灭多威是使用最广泛的杀虫剂之一。

灭多威在土壤中吸附能力较弱，迁移性强，水溶性高，因此很有可能会污染地表水或地下水。灭多威对人等哺乳动物具有高毒性，被美国EPA列为I类限制使用农药。其对环境的生物毒性表现为破坏动物间的捕食关系，威胁生态系统平衡等。除了损坏机体的抗氧化系统、各种器官和干扰内分泌危害外，灭多威还可能具有遗传毒性。由于灭多威在水中溶解性强、使用量大，加之工农业生产中的不合理排放，导致一些水体和食品中监测到灭多威残留。灭多威因在环境水体中检出率高和具有内分泌干扰作用等而被受到广泛关注。

获得灭多威降解菌株和降解基因在治理环境中的灭多威残留有以下作用：(1)用于土壤、水体中杀虫剂灭多威残留的消除；(2)通过基因研究构建基因工程菌株，进而研究酶学特性，对灭多威污染修复具有重要意义。因此降解基因在消除该杀虫剂残留具有非常重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种灭多威水解酶基因ameH；

本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白；

本发明的又一目的是提供该基因的应用；

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一个水解酶基因ameH，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

通过多种蛋白纯化和菌株基因组测序相结合的方法来寻找目的基因。首先运用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱、Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱和Sephadex-200凝胶层析等逐步纯化菌株MDW-2粗酶液中的灭多威水解酶。Sephadex-200凝胶层析后仍具有灭多威降解活性的蛋白电泳图(见图1)，虽然未获得单一的目的蛋白，但经多条具有酶活性的蛋白条带分析，初步确定该菌株的灭多威水解酶蛋白大小在30kDa左右。将该条带送往上海博苑生物科技有限公司进行肽指纹图谱分析；然后采用高盐法提取菌株MDW-2基因组，DNA样品送于凌恩生物科技公司进行基因组测序。通过肽段序列与菌株MDW-2基因组中的氨基酸序列进行同源性比对分析，发现与基因组中scaffold 60的orf06623的氨基酸同源性达到51％，因此对orf06623进行分析，将对应的编码基因命名为ameH。

所述的水解酶基因ameH编码的蛋白AmeH，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

含有所述的水解酶基因ameH的重组表达载体。