[发明专利]基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法

说明书

本发明公开了基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法，属于核酸检测技术领域。本发明通过设计捕获探针引物，然后与基因组DNA进行杂交反应，得到目的DNA片段后进行延伸、连接反应，后对目的DNA片段进行PCR扩增，纯化后即可进行文库测序。本发明的靶向区域捕获建库方法比较灵活，特异性高，捕获效率高，操作简单，耗时较短，并且能够尽量减少因PCR扩增效率差异造成的捕获区域均一性很差的现象。

技术领域

本发明涉及一种基于杂交、延伸连接反应的核酸捕获文库制备方法，属于核酸检测技术领域。

背景技术

高通量测序技术发展后测序成本降低，但测序之后的庞大的数据量分析工作难度加大。测序深度更高后导致测序的数据量越来越大，分析工作也是越来越困难。近年来测序技术的发展逐渐形成了两个方向：大而全的全基因组测序 (Whole Genome Sequencing)和小而精的靶向捕获测序(Target Capture Sequencing)。

与全基因组测序相比，捕获测序可以针对感兴趣的区域进行分离与富集，可以大大降低后续的数据分析工作。在遗传突变、肿瘤筛查等领域，靶向捕获所能达到的灵敏度也是全基因组测序完全无法实现的。由于捕获测序在测序前就对基因的目标区域进行了分离与富集，目标区域的大幅减少可实现5000×甚至更高的测序深度。测序深度的提高意味着更高的灵敏度(能够检测低频率的变异)，其检测极限低至0.1％。靶向捕获方法主要包括杂交捕获、分子倒置探针以及多重PCR。

杂交捕获根据核酸分子碱基互补杂交原理，设计分子探针。探针可以和目标区域通过碱基互补配对结合，从而将目标区段捕获。非捕获区域会被洗脱丢弃，之后通过变性(一般是调节PH值到碱性)将探针和捕获区段分开，被捕获的片段即可进行二代测序。一般来说，杂交捕获根据探针状态的不同分为固态杂交和液态杂交。优点是捕获的区段大，均一性好，缺点是特异性差。因为样本是随机打断，捕获时候可能与部分目的区段杂交，导致含有部分目的区段的片段被捕获。

分子倒置探针(MIP)技术优势是特异性好而且捕获完成后的片段直接完成了建库(杂交捕获后还需要构建测序文库，主要是添加Index和测序接头)。其原理是设计一个口袋状探针，H1和H2能和目标区段退火，然后利用DNA 聚合酶将探针缺口补齐，同时添加DNA连接酶，将缺口处磷酸二酯键连接，即可构成一个完整的环状探针。然后通过外切酶将游离的探针消化，完整的探针包括目标区段的序列，利用通用序列作为后续文库构建的引物(可添加index 和测序引物)，扩增产物可以直接作为二代测序文库。优点是特异性高，但是缺点是捕获效率不高。

多重PCR富集是目前应用比较广泛的，适合大规模样本的捕获方法，主要以Life公司和Illumina公司的两种方法为主：Ion Ampliseq最关键之处在于引物设计，该公司设计的引物可以满足1000-2000重单管反应。优点：方法简单，起始量低至10ng，在PCR产物以及石蜡样本中有明显优势。难点：引物池是需要丰富的引物设计经验，目前只有thermo做的好，并且将经验做成了软件，登陆www.ampliseq.com提交序列即可。Illumina公司的方法：针对目标区段设计两段探针，探针和DNA双链中的一条链杂交，通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用，将探针中间的缺口补齐。上下游探针携带有通用序列，之后利用携带通用序列的建库引物(index和测序引物等)进行扩增以后即完成建库。优点是保证多个扩增子扩增效率的一致性，缺点是连接反应操作繁琐，并且对起始模板浓度要求比较高。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种基于杂交、延伸连接反应的核酸靶向捕获测序文库制备方法，开发一种比较灵活的，操作简单，耗时较短的靶向区域捕获建库方法，尽量减少因PCR扩增效率差异造成的捕获区域均一性很差的现象。

本发明的第一个目的是提供一种基于杂交、延伸连接反应的核酸靶向捕获测序文库制备方法，包括如下步骤：