[发明专利]一种利用耐铀镉真菌强化植物修复铀镉复合污染土壤的方法

权利要求书

1.一种利用耐铀镉真菌强化植物修复铀镉复合污染土壤的方法，包括（1）筛选与鉴定耐铀镉真菌Fusariumsp.A-2；（2）采用耐铀镉真菌Fusariumsp.A-2强化博落回修复铀镉复合污染土壤；其特征在于：

从对铀镉具有富集能力的博落回根部分离筛选出耐铀镉的真菌菌株，经铀镉耐受性试验，筛选出耐性最强的真菌进行鉴定为Fusariumsp.A-2，保藏号CCTCC M 2019277，并将耐铀镉性最强的菌株，接种至博落回根部和含铀和镉土壤中进行盆栽实验，待植物生长120 d后，收割，测其生物量和体内铀和镉含量；

步骤一，植物样品的采集，采集的植物为长期生长在铀尾矿库区的博落回，采集方式为连根带土挖起，将根系装入黑色塑料袋，带回；

步骤二，真菌的分离，将采集回的博落回植株的根系，用自来水和去离子水洗净表层土壤，将根切割成长5 cm的根段，分别于体积分数为75%酒精和体积分数为0.2%升汞溶液中浸泡5 min和2 min，取出根段，用无菌水冲洗3次，随用无菌纱布蘸干根段表面水分，挑取根段，切割成长为1 cm的斜段，用镊子挑起接至孟加拉红培养基上并将其置于生化培养箱28℃培养；取最后一次清洗根段的无菌水0.2 mL涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，置于生化培养箱28 ℃培养，观察，待组织切块面长出菌后采用尖端菌丝挑取法，将不同形态的菌落分别在孟加拉红培养基上连续转接2-3次，最后将分离纯化得到的真菌菌株转入装有孟加拉红培养基的三角瓶中，放入4 ℃冰箱中保存；

步骤三，真菌铀镉耐受性测定，用天平称取1.792 g六水硝酸铀酰UO₂(NO₃)₂·6 H₂O和1.631 g氯化镉CdCl₂，分别配制质量浓度为1 g/L铀和1 g/L镉母液，并用0.22 μm滤膜对其过滤除菌，向灭菌的查氏培养基中同时加入铀和镉母液，使查氏培养基中铀的质量浓度为10、20、30、40、80和160 mg/L，镉的质量浓度为5、10、20、40、80和160 mg/L，以不添加铀和镉母液的查氏培养基作为空白对照，共7个处理，每个处理2次重复；

将步骤二的真菌菌株均在不含铀和镉的查氏培养基平板上培养7 d，用打孔器从真菌菌株的菌落边缘打取菌饼，接种至上述不同处理的查氏培养基平板上，并将查氏培养基平板置于生化培养箱培养28 ℃，15 d，每间隔2 d，采用十字交叉法测量菌落直径，采用最小抑菌浓度来衡量菌株耐铀镉性能；

步骤四，耐铀镉真菌的鉴定，通过形态观察和分子鉴定来确定耐铀镉真菌的分类学地位，采用核糖体内转录间隔区序列方法测序，并将所得ITS序列与已有的真菌序列进行相似性比对，绘制系统发育树，经过筛选与鉴定，对铀镉耐受性能最好的真菌为镰刀菌属真菌，命名为Fusariumsp.A-2，保藏号CCTCC M 2019277。