[发明专利]一种美澳型核果褐腐病菌的活性检测方法

说明书

本申请公开了一种美澳型核果褐腐病菌的活性检测方法。本申请的活性检测方法包括采用荧光染料对美澳型核果褐腐病菌孢子进行染色，根据染色情况判断活性；荧光染料为碘化丙啶和/或荧光素双醋酸酯；碘化丙啶染色条件为终浓度0.00025mg/mL对孢子进行4min避光染色；荧光素双醋酸酯染色条件为终浓度0.0025mg/mL对孢子进行16min避光染色。本申请的活性检测方法，能直接观察孢子死活，操作简单，整个检测过程不足30分钟，提高了活性检测效率。本申请的活性检测方法具有快速、准确、灵敏、重复性好等优点，能替代传统形态学检测，为口岸检疫、农业生产、植物保护等部门提供了一种新的快速、有效的检测方法和途径。

技术领域

本申请涉及美澳型核果褐腐病菌活性检测领域，特别是涉及一种美澳型核果褐腐病菌的活性检测方法。

背景技术

美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola(Winter)Honey)为子囊菌核盘菌科链核盘菌属，是一种危害多种水果的恶性真菌，其主要寄主为蔷薇科果树，其中对苹果、梨、油桃、李等危害最为严重。在田间，该病原菌主要的越冬方式是靠被侵染之后的果实和枝条，春季温暖而潮湿的天气适合分生孢子大量产生及分生孢子的萌发，病菌将进行侵染，一般从伤口入侵，也可以在果皮上直接侵染，初期发病症状轻微。在果实上刚发病时只出现褐色的小病斑，但适宜条件下几天之内就能使整个果实腐烂，果实表面产生大量的灰褐色粉状分生孢子，并且容易抖落，极易在运输途中传播。美澳型核果褐腐病对中国的水果生产具有很大的威胁，中国具有大量的野生感病寄主，且分布广泛，病菌的入侵严重危害中国的李子、桃、杏、苹果、梨、葡萄等大面积主要水果的生产，经济影响大。同时，在我国各个口岸也多次截获美澳型核果褐腐病菌，例如，在2012年美国进境樱桃中截获到该病菌、2014年在南京国际机场进境旅客截获该菌。美澳型核果褐腐病菌疫情也被视为中美植物检疫双边会谈的重要议题。

目前，美澳型核果褐腐病菌的活性检测主要依赖于传统的形态学鉴定方法，该方法需要对待测样品进行培养，不仅耗时长，而且对操作人员的主观依耐性较强，不能很好的满足实际检验检疫工作的需要。因此，为了更好的保护我国生态安全，建立美澳型核果褐腐病菌病原物孢子的活性检测方法成为当务之急。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的美澳型核果褐腐病菌活性检测方法。

本申请采用了以下技术方案：

本申请公开了一种美澳型核果褐腐病菌的活性检测方法，包括采用荧光染料对美澳型核果褐腐病菌孢子进行染色，然后观察染色结果，根据染色情况判断美澳型核果褐腐病菌的活性；其中，荧光染料为碘化丙啶和/或荧光素双醋酸酯；碘化丙啶(以下缩写PI)的染色条件为，在避光条件下，采用终浓度为0.00025mg/mL的PI对孢子进行4min染色；光素双醋酸酯(以下缩写FDA)的染色条件为，在避光条件下，采用终浓度为0.0025mg/mL的荧光素双醋酸酯对孢子进行16min染色。其中，PI染色后，死孢子发出红色荧光，活孢子无荧光；FDA染色后，活孢子发出绿色荧光，死孢子无荧光；根据死孢子和活孢子的数量判断美澳型核果褐腐病菌的活性。

需要说明的是，本申请的活性检测方法，其关键在于创造性的从现有的若干种荧光染料中研究出能够用于美澳型核果褐腐病菌活性检测的两种荧光染料，即PI和FDA；并且，创造性的研究并提出了基于这两种荧光染料的特别是针对美澳型核果褐腐病菌活性检测的具体染色条件。按照本申请的活性检测方法，能够有效的区分检测美澳型核果褐腐病菌的死活，并且，本申请的活性检测方法，从制样、染色到获得活性检测结果，整个检测过程不足30min，大大缩减了美澳型核果褐腐病菌活性检测的时间，提高了检测效率。

还需要说明的是，本申请的美澳型核果褐腐病菌活性检测方法中，PI和FDA，两种荧光染料可以单独使用进行活性检测，也可以组合使用，通过复染的方式使死孢子和活孢子更有效的区分，复染的具体方法详见后续方案。