[发明专利]一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂及其制备和应用

说明书

本发明属于粪便检测技术领域，具体涉及一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂及其制备和应用。本发明的保存液，能够在常温条件下，长时间地有效抑制粪便样本中细菌的增长，防止核酸的降解，并且能够温和释放粪便中的脱落细胞核酸而不大量地释放细菌核酸，离心后获得的上清液可以直接用于DNA提取、纯化或核酸检测，方便和后续的操作衔接，并且对后续的检测无影响，使用方便。

技术领域

本发明属于粪便检测技术领域，具体涉及一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂及其制备和应用。

背景技术

相对于血液中的癌症指标，某些癌前病变信号更早在肠道脱落细胞中出现，而且特异性高，并且运用粪便进行检测无创无痛，采样方便，所以用粪便样本进行某些疾病检测或癌症早筛越来越多。粪便样本，其成分十分复杂，含有大量的食物残渣、腐殖酸、色素、各种核酸降解酶和微生物等，而正常的人粪便中脱落的细胞及其核酸极少，所以，粪便样本的保存，特别是其中极少的脱落细胞及其核酸保存成为运用粪便样本脱落细胞检测的关键。

现有的粪便样本保存和运输，很多是在-20℃及以下保存，干冰运输，如果保存或运输过程中温度出现变化，特别是室外气温较高时，很容易导致其中的核酸降解或微生物增殖，这样限制了粪便样本检测的运用。目前，也出现了不少可以常温保存粪便样本的保存试剂，但这些保存试剂，基本只能保证抑菌和抑制核酸降解，后续提取核酸一般是提取保存液中的沉淀或固液混合物中的核酸，而粪便样本中的杂质和微生物基本都在沉淀和固体中，所以提取的核酸中含有大量的微生物核酸和杂质，宿主核酸含量非常低，必然影响后续的检测和处理，所以不大适用于检测粪便样本中的宿主脱落细胞核酸的场景。

现有技术中公开了较多的粪便样本保存液的技术方案，如CN108893523A《一种粪便样品常温保存液》公开了如何释放保存粪便样本里的肠道菌群的技术方案，保存液中使用了硫氰酸胍等强效裂解成分，才能释放有细胞壁结构的肠道菌群的核酸。但因为粪便里绝大部分是肠道微生物，如果让肠道菌群完全释放核酸，宿主细胞核酸将被完全掩盖，导致后续无法检测宿主细胞核酸。

CN106596211A《粪便样本保存液及其制备方法和应用》公开了如何保存粪便样本里肠道菌群微生物和脱落细胞，使其维持细胞形态，并且保存已经释放的所有核酸，而不是主动释放粪便样本里的核酸的技术方案，因此在保存液中用到固定剂和抗凝剂等成分，维持细胞形态，而不含任何裂解成分。

因此，开发一种释放并保存粪便样本里的宿主脱落细胞及其核酸，并且抑制肠道菌群的粪便保存液是未来的研究方向。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种粪便脱落细胞及其核酸保存试剂及其制备和应用，目的是实现在常温和气温较高的极端环境下，长时间抑制粪便样本中细菌的增殖和核酸降解，还可以温和地释放粪便样本中的脱落细胞核酸而不大量地释放微生物核酸，离心后得到的粪便上清，可以直接用于核酸提取或纯化后直接检测，因为后续提取不用处理粪便沉淀和固体，所以相对于其他保存液，获得的DNA中，获得的宿主核酸含量高，且核酸质量较好，用市面上常用的核酸提取试剂盒和处理方法即可提取，不影响后续检测，向后兼容性非常好，非常适用于需要检测粪便样本中宿主脱落细胞核酸的场景。

本发明的粪便脱落细胞及其核酸保存试剂，包括缓冲试剂、金属离子螯合剂、抑菌剂、离子型去垢剂和表面活性剂；其中所述的缓冲试剂是pH 7～10的50mM～1M Tris-HCl或磷酸盐缓冲液；所述的金属离子螯合剂是1mM～100mM乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性盐中的至少一种；所述的抑菌剂是二醇类、苯甲醇、苯乙醇、ProClin^TM300和NaCl中的至少一种；所述的离子型去垢剂选自浓度0.1％～10％的十二烷基硫酸钠、十二烷基璜酸钠、十二烷基硫酸锂、癸基硫酸钠、辛基硫酸钠、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、尿素等中的至少一种；所述的表面活性剂为非离子型去污剂，包括浓度0.5％～10％Brij-35、Tween-20、Tween-80、NP40和Triton-100中的至少一种。