[发明专利]一种基于RNA-Seq开发的小扁豆EST-SSR标记及应用

说明书

本发明公开了一种基于RNA‑Seq开发的小扁豆EST‑SSR标记及应用，本发明通过转录组测序组装技术大规模开发了125个小扁豆EST‑SSR标记，给出了这些标记所对应的正反向引物序列，提供这些标记的筛选过程，并且阐述了这些EST‑SSR标记在小扁豆种质资源遗传多样性分析方面的应用。本发明开发的EST‑SSR标记成功率较高、多态性丰富，其在94份小扁豆种质DNA中均能扩增出多种类型的条带，显示了良好的通用性，并且这些EST‑SSR引物的多态性十分丰富，对小扁豆分子辅助育种帮助颇大。

技术领域

本发明涉及一种基于RNA-Seq开发的小扁豆EST-SSR标记及应用，涉及分子标记技术领域。

背景技术

小扁豆是一年生自花受粉、长日性草本植物，同时也是一种重要的冷季食用豆，二倍体 (2n＝2x＝14)植物，基因组大小约为4G。小扁豆是世界第六大食用豆。小扁豆是人类饮食中蛋白质、糖类、维他命和微量元素的重要来源，同时也是牲畜高价值饲料。小扁豆因其固氮能力而有益于作物轮作。但是，由于小扁豆常被种植在贫瘠的土壤中，并且受到干旱、高温胁迫以及各种病害，诸如枯萎病、炭疽病、锈病、颈腐病、根腐病和白霜病等原因的影响，小扁豆的单产量仍然较低。根据2016年FAO数据，世界平均单产只有1,152kg/ha。因此，利用合适的育种策略提高小扁豆的产量显得十分迫切。

通过传统的育种方法成功地将一些质量性状基因导入到小扁豆主流品种中，然而传统方法在导入数量性状基因时效果不佳且费时费力，通常受环境或基因型环境互作影响较大。而分子标记在种质资源多样性研究和分子辅助育种中有着广泛的应用。其中简单重复序列 (Simple sequence repeat，SSR)广泛存在于真核生物的基因组中，数量众多，重复性高，是最常用的分子标记之一。EST-SSR是从表达序列标签库(EST)或转录组测序数据中挖掘的SSR，与基因组SSR相比，其开发相对容易。

目前，EST-SSR已广泛应用于大麦、樱桃和甘蔗的遗传研究中，但其在小扁豆中的应用研究较少。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种基于RNA-Seq开发的小扁豆EST-SSR标记及应用。本发明提供了通过转录组测序组装技术大规模开发了125个小扁豆EST-SSR标记，并且阐述了这些EST-SSR标记在小扁豆种质资源遗传多样性分析方面的应用。

一组小扁豆EST-SSR标记，包括如下125个位点所对应的正向引物和反向引物：

注：*表示预测值与实际值不相等，列出实际值。

进一步的，上述小扁豆EST-SSR标记在小扁豆种质遗传多样性分析中的应用。

进一步的，上述小扁豆EST-SSR标记的引物是通过如下方法得到的：

1)选取6份来源地不同的小扁豆材料，提取RNA建立cDNA文库，并在Illumina平台上测序，获得原始reads；

2)将上述步骤1)获得的原始reads通过数据处理获得clean reads，将cleanreads组装拼接后形成Transcript和unigene；

3)利用步骤2)获得的unigene设计SSR引物对，并从另外的88份小扁豆材料中选取来源地不同的4份小扁豆材料提取DNA作为PCR扩增模板，进行PCR扩增，根据扩增情况筛选EST-SSR引物；

4)提取步骤1)中所述的6份小扁豆材料和步骤3)所述的88份小扁豆材料(共计94份)的DNA作为PCR扩增的DNA模板，步骤3)中筛选的EST-SSR引物添加荧光标记后作为PCR扩增的引物，进行PCR扩增，利用扩增产物进行荧光标记毛细血管电泳从而验证步骤3)中筛选出的EST-SSR引物。