[发明专利]一种适冷耐盐硝基还原酶及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了一种适冷耐盐硝基还原酶及其编码基因与应用，其目的是提供一种适冷耐盐硝基还原酶及其编码基因与应用。本发明首先从南极海冰微生物嗜冷杆菌（Psychrobactersp.）中克隆得到了过氧化物还原酶基因PsNTR，其氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。其表达方式是利用冷激质粒pColdI构建含有硝基还原酶基因PsNTR的重组表达载体，并将构建的重组表达载体转入大肠杆菌宿主细胞（Escherichia coli），经诱导使硝基还原酶PsNTR基因表达。本发明的表达产物PsNTR具有突出的耐盐性，具有良好的多种芳香硝基化合物降解能力，具有广阔的应用前景。此外，本研究中构建的重组基因工程菌株在低温条件下表现出良好的硝基苯降解能力，可应用于低温环境下芳香硝基化合物的降解及食品医药等相关领域。

技术领域

本发明属于酶工程及环境、医药等相关领域，具体涉及一种适冷耐盐硝基还原酶及其编码基因与应用。

背景技术

随着工农业的迅速发展，芳香硝基化合物被广泛应用于染料、杀虫剂、炸药、农药、医药及其他化工产品的生产。然由于芳香硝基化合物在环境中具有一定的稳定性及持久性，且易使人体产生免疫毒性、血液毒性，并具有致癌致畸的潜在危险，其高效降解引起了人们的广泛关注。其中，对硝基基团的还原是实现芳香硝基污染物降解的关键步骤。硝基还原酶降解法作为一种新型的高效的芳香硝基化合物降解方法，能够更有效地将硝基基团还原为相应氨基衍生物。此外，硝基还原酶因其解毒潜力以及在生物修复、生物催化、生物医学等领域的生物技术应用，特别是在化疗肿瘤治疗的前药活化、肿瘤细胞和体内荧光探针等诸多方面的应用，越来越受到人们的关注。

从动植物中提取的硝基还原酶易受时节、气候和地域的限制，且稳定性较差，难以直接应用于工业生产等相关领域。利用重组基因工程菌诱导表达是降低成本和获得具有天然活性的硝基还原酶的有效途径。

南极是能够在低温下高效催化底物反应的适冷酶的主要来源，且南极海冰环境中含有多种芳香硝基化合物。鉴于上述论述，从南极微生物Psychrobactor sp.体内克隆得到适冷耐盐硝基还原酶，且该基因在大肠杆菌中实现了表达，重组硝基还原酶PsNTR及其重组表达菌株具有降解包括硝基苯在内的多种芳香硝基化合物的能力，可应用于环境中相关污染物降解及食品医药等相关领域。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种表达法方法简单易行，表达产物易纯化且具有低温高盐催化特性的硝基还原酶PsNTR及其编码基因和应用。

本发明的第一个目的在于提供一种适冷耐盐的硝基还原酶PsNTR的基因序列和由此推断的氨基酸序列。本发明的适冷耐盐硝基还原酶PsNTR其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该适冷耐盐硝基还原酶PsNTR全长813 bp，编码270个氨基酸。

含有上述适冷耐盐硝基还原酶PsNTR的重组表达载体。

所述的表达载体优选为冷激载体pColdI。

一种含有上述重组表达载体的基因工程菌。

所述的工程菌优选为E. coli BL21 (DE3)。

培养含有本发明的适冷耐盐硝基还原酶PsNTR基因的宿主细胞的培养基和培养条件均可为培养出宿主细胞的培养基和培养条件。其中，培养所述组宿主大肠杆菌细胞时，在35-40 ℃下培养至OD₆₀₀为0.4-0.8，培养基中加入IPTG至终浓度为0.5-1.5 mM，12-20 ℃下诱导发酵20-28 h，即可高效诱导表达适冷耐盐硝基还原酶PsNTR。

所述对表达产物重组适冷耐盐硝基还原酶PsNTR进行优化的方法优选为Ni柱亲和层析法。