[发明专利]一种微藻总核糖核酸样品制备方法

说明书

本发明涉及一种微藻总核糖核酸(RNA)样品制备技术，具体的说是对于高糖能源微藻特点而开发的一种总RNA提取纯化方法。本发明以微藻生物质为原料，经过液氮研磨、均相试剂提取和纯化，最终获得满足高通量测序所需要的总RNA样品。本发明操作简单，尤其适用高糖微藻总RNA样品制备。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微藻总RNA的提取方法，尤其适用于从高糖微藻样品提取总RNA用于转录组学的研究。

背景技术

微藻因其生长快速、可通过简单培养调节代谢通路，定向富集储能物质而成为新一代天然、低成本并且绿色环保的能源原料、工业原料或食品原料。在对微藻代谢通路调控机制的研究中，转录组测序是一种高效、经济的技术手段，近年来已在微藻研究领域中被广泛应用。通过转录组信息可以对微藻细胞中基因在特定环境与时间下的转录情况进行定性与定量，但转录组测序需要高质量的RNA样品才能准确的展现细胞在特定时间阶段的转录情况。

高糖微藻细胞中富含多种多糖。多糖与RNA的多个理化性质相似，在沉淀RNA时，多糖往往会与RNA共同沉淀，形成富含多糖的凝胶状RNA沉淀，并会形成大量的挂壁。去除多糖的过程中，部分RNA容易被一同去除，从而降低RNA的得率，而增加的步骤又给总RNA增加了很大的降解风险。尤其在胁迫环境下培养的微藻，细胞本身的RNA已经开始降解，长时间的提取与纯化步骤会进一步降低样品质量，所产生的差异会在后续测序过程中的PCR倍增步骤中被进一步放大，使得转录组测序的定量出现显著误差。另外，多糖会抑制部分酶的活性，同样会对后续的建库与测序产生干扰。

本发明基于酚类及异硫氰酸胍等试剂提取细胞总RNA的技术，从新鲜收集或低温保存的高糖微藻细胞中提取总RNA，可直接用于转录组测序的建库，是一种高效、简洁的获取高质量RNA样品的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题为高糖微藻细胞中提取总RNA质量不高，提取率较低的问题，提供了一种微藻总RNA样品制备技术，本发明所属方法可以高效、简洁的获取高质量RNA样品。

本发明提供一种微藻总RNA样品制备技术，包括以下步骤：

①在即将使用的研钵中加入2/3体积的液氮，等待液氮完全蒸发；②将藻泥样品在融化前置于研钵中，加入少量液氮，在液氮中将藻沉淀磨成粉末状，过程中需再加1-2次液氮；③按照100mg藻沉淀/1mL TRIzol比例加入TRIzol(Ambion-Life Technologies Co.,Carlsbad,CA,USA)将藻粉覆盖住，然后加入少量液氮使其变固体，并在室温融化，融化过程中在膏状时用研杵充分搅拌；④完全融化后用研杵混匀样品与试剂，每1000μL转移至一个新的1.5mL离心试管中，12000g离心5min，取上清750μL，完全不吸入破碎物；⑤每个离心管加入150μL体积的氯仿，手振15s，室温静置5min，之后12000g离心15min；⑥取上清，完全不触碰到中间层，留有较大距离以防吸入，加入375μL的异丙醇，混匀，室温静置10min，12000g离心10min，弃上清；⑦加入1mL 75％乙醇，上下颠倒清洗沉淀，12000g离心5min，尽可能的去除乙醇；⑧室温干燥2-5min，用100μL DEPC-H₂O依次溶解20min后，分别定量和琼脂糖凝胶电泳验证。

本发明关键操作内容注意事项包括：

(1)操作环境干净无尘，事先用DNARNase Away处理，严格戴好口罩、头套、手套；

(2)移液器杆、实验台面彻底处理，枪头、离心管等耗材、试剂均采用无RNase的耗材与试剂；

(3)样品加入TRIzol后的冻融过程可以提高RNA提取率；

(4)去除乙醇步骤中，按顺序分别使用1000μL，100μL，10μL移液器尽量去除乙醇，可以显著降低RNA样品中盐含量。