[发明专利]基于核酸酶偶联PCR原理富集低丰度DNA突变的检测技术体系及应用有效
| 申请号： | 201910324580.2 | 申请日： | 2019-04-22 |
| 公开（公告）号： | CN109880891B | 公开（公告）日： | 2021-07-30 |
| 发明（设计）人： | 冯雁;刘倩;荀冠华;郭翔;李忠磊;崇曰盛 | 申请（专利权）人： | 上海交通大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6858 | 分类号： | C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 上海一平知识产权代理有限公司 31266 | 代理人： | 徐迅;王正君 |
| 地址： | 200240 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 核酸酶 pcr 原理 富集 低丰度 dna 突变 检测 技术 体系 应用 | ||
1.一种提高目标核酸的相对丰度的方法，其特征在于，包括步骤：
(a) 提供一核酸样本，所述的核酸样本含有第一核酸和第二核酸，其中，所述的第一核酸为所述目标核酸，而所述的第二核酸为非目标核酸，
并且，所述目标核酸在所述的核酸样本中的丰度为F1a；
(b) 对所述核酸样本中的核酸为模板，在扩增-切割反应体系中进行聚合酶链反应(PCR)和核酸切割反应，从而获得扩增-切割反应产物；
其中，所述的核酸切割反应用于特异性切割非目标核酸，但不切割所述目的核酸；
并且，所述的扩增-切割反应体系含有(i)进行PCR反应所需的试剂和(ii)进行核酸切割反应所需的试剂；
其中，所述目标核酸在所述的扩增-切割反应产物中的丰度为F1b，
其中，当0.1%≤F1a≤0.5%时，F1b/F1a的比值≥100；所述的“进行核酸切割反应所需的试剂”包括：核酸切割工具酶和引导DNA(gDNA)，所述核酸切割工具酶选自以下来自嗜热微生物的Argonaute蛋白（Ago）：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标核酸和非目标核酸仅相差一个碱基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标核酸为含突变的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸切割工具酶选自以下来自嗜热微生物的Argonaute蛋白（Ago）：
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引导DNA与目标核酸，即第一核酸的靶定区域的核酸序列形成第一互补结合区；并且所述的gDNA还与非目标核酸，即第二核酸的靶定区域的核酸序列形成第二互补结合区。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸切割工具酶和gDNAs的比例为1：2～1：20。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
(c) 对所述扩增-切割反应产物进行检测，从而测定所述目标核酸的存在与否和/或数量。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一核酸包括n种不同的核酸序列，其中n为≥1的正整数。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，进行C个“高温变性-延伸”循环，其中C为≥5。
10.一种扩增-切割反应体系，其特征在于，所述反应体系用于对一核酸样本同时进行聚合酶链反应(PCR)和核酸切割反应，从而获得扩增-切割反应产物；
其中，所述的核酸样本含有第一核酸和第二核酸，其中，所述的第一核酸为所述目标核酸，所述的目标核酸为含突变的核苷酸序列，而所述的第二核酸为非目标核酸，所述的非目标核酸为野生型核苷酸序列、高丰度的核苷酸序列、或其组合；
所述的核酸切割反应用于特异性切割非目标核酸，但不切割所述目的核酸；
所述的扩增-切割反应体系含有(i)进行PCR反应所需的试剂；(ii)进行核酸切割反应所需的试剂；和(iii) 核酸样本，所述的核酸样本含有第一核酸和第二核酸，其中所述的第一核酸为所述目标核酸，所述的目标核酸为含突变的核苷酸序列，所述的第二核酸为非目标核酸，所述的非目标核酸为野生型核苷酸序列、高丰度的核苷酸序列、或其组合；所述的“进行核酸切割反应所需的试剂”包括：核酸切割工具酶和引导DNA(gDNA)，所述核酸切割工具酶选自以下来自嗜热微生物的Argonaute蛋白（Ago）：
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