[发明专利]一种检测分析血液中特定细胞外囊泡的方法及其用途

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及检测分析血液中特定细胞外囊泡的方法及其用途。尤其是检测分析血液中特定细胞外囊泡的数量和比例，有助于预测患者动脉粥样硬化病程及其急性心血管事件的发生几率。本发明还提供了根据检测动脉粥样硬化患者外周血中细胞外囊泡数量，CD47⁺细胞外囊泡以及Annexin V⁺细胞外囊泡的比例结果，用于制备预测患者动脉粥样硬化病程的水平及其发生急性心血管事件的几率的制剂或工具模型；其中尤其是细胞外囊泡、CD47⁺细胞外囊泡以及Annexin V⁺细胞外囊泡用于制备检测及治疗动脉粥样硬化制剂中的应用。该发明有望成为临床心血管疾病的预测提供新技术支持和检测分析方法。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及检测分析血液中特定细胞外囊泡的方法及其用途。尤其是检测分析血液中特定细胞外囊泡的数量和比例；本发明方法有助于预测患者动脉粥样硬化病程及其急性心血管事件的发生几率。

背景技术

研究显示，动脉粥样硬化是与严重健康问题相关的常见心血管疾病之一，同时也是导致发病和死亡的主要原因，动脉粥样硬化的病理学特征是内皮下的脂质细胞的积累和动脉内膜中形成动脉粥样化或脂肪沉积[1]。冠状动脉粥样硬化的过程会阻碍血液流动，导致远端血管堵塞，引起相关的急性心血管事件如急性心肌梗死、不稳定心绞痛等的发生，从而严重威胁到患者的生命。

研究表明，动脉粥样硬化的形成分为三个阶段:首先，冠状动脉动脉血管内皮细胞受到各种有害刺激如，高血压、高血糖、高血脂、氧化应激等时被激活，分泌粘附分子如ICAM-1等，促进白细胞粘附，与此同时，内皮通透性增加和内皮下细胞外基质成分改变，促使氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)在动脉壁上集聚，被清道夫受体识别进入巨噬细胞，形成泡沫细胞；然后，内皮细胞分泌的细胞因子和生长因子，诱导平滑肌细胞增殖和迁移，形成由纤维组织、平滑肌细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞构成的纤维帽；最终，损伤的内皮细胞、泡沫细胞、大量脂质、钙质沉积、病理血管重建构成斑块核心[2]。目前，由于动脉粥样硬化发病的具体分子机制尚不明确，导致临床实践中尚缺乏有非常明确的针对动脉粥样硬化的诊断方法及治疗药物。

急性心血管事件(Acute Cardiovascular Event)是由于血管因长期动脉粥样硬化，并不断进展，进而产生的如急性冠脉综合征(Acute Coronary Syndromes, ACS)等急性缺血性心脏病变。研究显示，发生急性心血管事件的主要原因是由于冠状动脉内不稳定的粥样硬化斑块破裂或糜烂继发新鲜血栓形成所导致的心脏急性缺血综合征。由于缺少必要的诊断及预测方法，急性心血管事件目前是导致动脉粥样硬化患者死亡的最主要原因之一。据统计，每年死于动脉粥样硬化并发的急性心血管的人数达到1500万人，而其中，我国占1/5[3]；故而，进一步研究动脉粥样硬化的机制，并从中发掘能作为该疾病预测和预后的分子至关重要。

细胞外囊泡是指由细胞分泌的大小约在20-10000nm左右的小泡，这些小泡负责细胞与细胞之间的通讯，虽然细胞凋亡时释放凋亡小体早就被报道,但是健康的细胞从细胞膜释放囊泡是最近才被关注，它们主要包括微囊泡 (microvesicles)、凋亡小体(apoptotic body)和外泌体(exosome)等[4]；

外泌体是磷脂双分子层包围的细胞外囊泡,直径为20-200nm,可以由静息细胞释放,或诱导释放，外泌体释放是通过内吞体向内凹陷形成多泡体 (multivesicularbody,MVB),再由多泡体与细胞膜融合而释放的，外泌体不仅可以横向传递mRNA和miRNA、致癌受体(oncogenetic receptor)和艾滋病病毒颗粒 (HIV particle),还具有抗原呈递、免疫激活和免疫抑制活性,表达D63、CD81、 CD9、LAMP1、TSG101等标志物[5]；