[发明专利]用于检测POLE基因突变的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测POLE基因突变的引物、探针及试剂盒。本发明所述的引物、探针组合及试剂盒能够基于实时荧光PCR技术平台实现POLE基因突变的准确检测，具有检测速度快、易于判读结果、检测试剂成本低、检测灵敏度高、特异性强的优点，同时适用于检测组织样本DNA和血浆游离DNA。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种用于POLE基因突变检测的引物、探针组合及试剂盒。

背景技术

癌症发病率近年来呈逐年上升趋势，我国每年新增癌症患者达350万人以上。随着肿瘤细胞分子生物学的发展，癌症免疫治疗已开始进入临床应用，选择合适的患者进行免疫治疗是其成功的关键。

POLE基因负责编码DNA聚合酶ε的催化亚基，具有以DNA为模板的聚合酶活性，以及核酸外切酶区的校正活性，负责对错配碱基进行识别和修复。其中，校正活性能够及时识别并切除复制过程中产生的错误碱基。

POLE基因发生突变，常发生在核酸外切酶区，该区域基因突变可导致所编码的DNA聚合酶ε核酸外切酶区域的校正功能缺失，在DNA复制过程中会导致基因突变率异常增加，异常增加的突变将促进肿瘤的发生。通过外显子组测序发现，POLE突变的体细胞内突变率很高，肿瘤突变负荷(TMB)非常高。POLE体细胞突变常发生在约1～2％的结直肠癌(CRC)中和7～12％的子宫内膜癌(EC)中，并且在脑，胰腺，卵巢，乳房，胃的超突变肿瘤以及子宫癌肉瘤中被检测到，最常见的突变类型是P286R和V411L，以及S297F、A456P、S459F和F367S，这些突变直接或间接的影响了DNA聚合酶ε核酸外切酶区域的校正功能。另外，POLE种系突变具有家族遗传性及致癌性，主要发生在肠息肉病患者和家族性结直肠癌中，发生率约为0.5～2％，突变类型主要是L424V。

研究发现，POLE基因突变可增强癌症患者免疫应答，可能原因是由于肿瘤细胞积累了大量的基因变异，导致产生的蛋白更容易被患者的免疫系统发现。研究人员在肿瘤免疫染色中发现POLE突变的肿瘤中存在大量的CD8+阳性的肿瘤浸润淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞标志物，PD-1＞90％，并在肿瘤微环境中鉴定出PD-L1的大量表达，表明具有POLE突变的肿瘤可能是靶向PD1-PDL1信号通路药物的候选者。已有临床研究报道携带POLE基因突变的癌症患者接受针对PD-1的免疫治疗具有良好的疗效。

由此可见，在癌症患者中检测POLE基因突变，可以预测免疫治疗的效果，指导医生制定合理的治疗方案，避免延误患者的最佳治疗时机。

针对晚期癌症患者，当无法通过活检取组织样本检测时，可通过采集全血、分离血浆中游离DNA来实现基因突变的检测。由于活检组织量很少，血浆游离DNA浓度也很低，其中所含的基因突变比例也可能很低，因此不论针对组织样本还是血浆样本，均要求基因突变检测试剂具有高灵敏度和高特异性。

目前针对POLE基因突变检测方法包括高通量测序(NGS)、数字PCR(dPCR)。NGS方法检测灵敏度可达0.2％，但其检测步骤繁杂、试剂费用昂贵、结果判读依赖于生物信息学分析计算，检测周期长；数字PCR方法检测灵敏度可达0.1％，但其检测步骤较多、试剂费用较实时荧光PCR昂贵很多、结果判读也依赖于专用软件、对阴性/阳性区间的划分主要依赖于针对图形的主观判断。NGS和数字PCR仪器试剂昂贵，因此对操作人员也有很高要求。

鉴于此，目前亟需能够快速、简便、高灵敏度、高特异性、试剂费用低、结果易于判读的检测POLE基因突变的试剂。特提出本发明。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于实时荧光PCR技术平台的、用于同时检测POLE基因8种突变型的引物、探针和试剂盒。本发明包括下列4组16条引物和探针：

第1组

正向引物POLE-1-F1：ACTGCCCCTCAAGTTTAG(SEQ ID No：1)