[发明专利]同时对柯萨奇A6型、A10型进行精确定量的PCR方法及试剂盒

说明书

本发明涉及同时诊断柯萨奇A6型、A10型的方法及试剂盒。本发明揭示了一种可特异性鉴定柯萨奇病毒A6型、A10型的引物，所述引物针对含有柯萨奇病毒A6型、A10型的DNA可发生特异性扩增，而对其它血清型以及其它物种不发生特异性扩增。本发明还提供了一种简化的PCR检测方法，所述的方法可良好地应用于鉴定柯萨奇病毒A6型、A10型，并且具有非常优异的再现性、灵敏度。

技术领域

本发明属于诊断领域，更具体地，本发明涉及同时诊断柯萨奇病毒A6型、A10型的方法及试剂。

背景技术

近年来全球食源性疾病和恶性食品污染事件频频的发生，使食品安全已成为一个巨大并不断扩大的世界卫生问题，并日益成为全球关注的热点。世界卫生组织将食品安全看作是一个世界性的挑战。全球每年发生40～60亿例食源性腹泻，而许多食源性疾病的大规模暴发都是由病毒引起的。其中以受污染的水、贝类和果蔬为载体而导致的病毒性疾病如诺瓦克病毒、轮状病毒、科萨奇和甲肝病毒为主要病因较为常见。提高食源性致病微生物快速监测的准确性和控制的时效性是解决食源性病毒疾病暴发问题的关键。

柯萨奇病毒(Coxsackievirus，CV)根据对小白鼠的致病性不同分为A和B组，A组包括23个血清型，B组包括6个血清型。柯萨奇病毒能够引起人类多种感染性疾病，包括无菌性脑膜炎、病毒性心肌炎、疱疹性咽峡炎和手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)等。手足口病是中国法定丙类传染病。柯萨奇病毒A组16型(CVAl6)被认为是手足口病的主要病原体，近年来柯萨奇病毒A组6和10型引起的手足口病病例也呈明显上升趋势。B组可引起呼吸道感染、腹泻、脑膜炎、心肌炎等，是儿童病毒性心肌炎最常见的原因。该病可通过粪口途径以及呼吸道飞沫传播，或经接触患者皮肤、黏膜的疱疹液而感染。手足口病具有传染性很强、传播快的特点，极易造成暴发流行，危害婴幼儿的生命健康。

但是，柯萨奇病毒的病毒血清型特别多，不同血清型近似度高，不易于进行准确的血清型分辨，常常因为多种血清型的干扰而导致检测结果假阳性或假阴性，严重影响到检测结果的判断。因此，合适的检测试剂的开发以及检测方法的优化是尤为重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时诊断柯萨奇病毒A6型、A10型的方法及试剂。

在本发明的第一方面，提供一种同时测定柯萨奇病毒A6型、A10型的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示核苷酸序列的引物进行PCR扩增，并以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针进行识别；若存在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的扩增产物，则柯萨奇病毒A6型阳性；若存在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5的扩增产物，则柯萨奇病毒A10型阳性。

在一个优选例中，所述的SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针进行锁核酸修饰。

在另一优选例中，对SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的第3、4、14和15位碱基进行锁核酸修饰。

在另一优选例中，所述的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针携带荧光标记，且两者的荧光标记不同。

在另一优选例中，在进行PCR扩增时，采用的退火温度为56～59℃。

在另一优选例中，在进行PCR扩增时，采用的退火温度为56.2℃和58.7℃。

在另一优选例中，所述的待测样品包括：食品、饮料、保健品。

在另一优选例中，所述方法的检测下限为1拷贝。

在另一优选例中，所述的方法是不以疾病诊断为目的的方法。