[发明专利]一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺

权利要求书

1.一种新型无花果植物来源的溶菌酶，其特征在于：包括重组后的表达序列、宿主菌株、表达载体、发酵工艺，重组后的表达序列为无花果溶菌酶的N-端序列1-129氨基酸，根据蛋清溶菌酶活性位点Glu35和Asp52的位置，通过基因序列改变将无花果溶菌酶的第35和52位置的氨基酸变成谷氨酸和天冬氨酸。

2.根据权利要求1所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶的发酵生产工艺，其特征在于，包括以下几个步骤：

S1、表达序列的获取：根据蛋清溶菌酶活性位点Glu35和Asp52的位置，通过基因序列改变将无花果溶菌酶的第35和52位置的氨基酸变成谷氨酸和天冬氨酸；

S2、质粒的提取：从实验室构建好的毕赤酵母菌株中提取质粒；

S3、设计特性引物：以基因序列改变后的无花果溶菌酶的N-端序列1-129氨基酸序列为模板，设计用于真核细胞表达系统的特性引物R1和R2；

S4、基因的扩增：以基因序列改变后的无花果溶菌酶的N-端序列1-129氨基酸序列为模板，用引物R1和R2进行PCR扩增；

S5、重组质粒的构建：PCR产物纯化后，用酶切连接的方法将目的基因与表达载体相连，得到重组表达载体；

S6、重组子的鉴定：用菌落PCR方法进一步筛选，并进行双酶切验证以及测序验证：

S7、菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株中，得到含有重组质粒的菌株：

S8：植物源重组溶菌酶的高效表达：利用甲醇诱导重组毕赤酵母高效表达植物源重组溶菌酶。

3.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所述步骤S3中，R1为GCGTGAATTCGTGATGGGAGGTCGACTG，R2为GCGGCCGCCGCCATTCGGGTCCGG。

4.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所述步骤S5中，所述的表达载体为细胞外表达载体，包括但不限于pPIC9K、pPICZα、pCMVp-NEO-BAN。

5.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所述步骤S7中，所述的宿主菌株为毕赤酵母菌株，包含但不限于以下型号：GS115、KM71、MC100-3、SMD1168。

6.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所述步骤S8中，利用甲醇的类型为甲醇利用正表型、甲醇利用缓慢表型、甲醇利用负表型中任意一种。

7.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所述步骤S8中，采用甲醇诱导中，甲醇浓度为0.1%~5%，发酵时间为24~72h。

8.根据权利要求2所述的一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，其特征在于：所用的内切酶为EcoR I和Not I。