[发明专利]多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法

说明书

本发明公开了一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法：(1)标准品的酶解；(2)固相萃取富集目标肽段；(3)高效液相色谱串联质谱分析；(4)绘制标准曲线，得标准工作曲线方程；(5)样品检测，计算得到样品中各特征肽段的浓度；(6)计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率。本发明实现了多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合率的多位点定量监测，其中破伤风蛋白涉及20个监测位点，CRM197涉及16个监测位点。本发明不仅可以检测残留蛋白含量，还可以评价多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合位点的结合率，也可用于多糖或蛋白残余率相同但活性和毒性不同的多糖蛋白结合疫苗的研究，可为改进多糖蛋白结合工艺提供直接的监测方法。

技术领域

本发明涉及一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，属于疫苗质量评价技术领域。

背景技术

多糖蛋白结合疫苗是将多糖通过化学键与蛋白结合后形成的一类疫苗。用于多糖蛋白结合疫苗的蛋白称为蛋白载体。常用蛋白载体有CRM197蛋白，白喉类毒素(即甲醛脱毒的白喉蛋白)和破伤风类毒素(即甲醛脱毒的破伤风蛋白)。常见的多糖蛋白结合疫苗包括四价脑膜炎疫苗(A、C、W、Y)，Hib疫苗和13价肺炎多糖疫苗(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F)。与多糖疫苗相比，多糖蛋白结合疫苗具有不同的免疫用途。如23价肺炎疫苗(多糖疫苗)用于2岁以上儿童和成人，对2岁以下儿童免疫效果较差，而13价肺炎疫苗(多糖蛋白结合疫苗)由于有蛋白载体辅助作用，可以很好的激发2岁以下儿童T细胞的免疫反应，从而达到预防多种肺炎病毒入侵的作用。与多糖疫苗相比，多糖蛋白结合疫苗具有制备工艺更复杂，质量控制更困难的问题。多糖蛋白结合疫苗往往需要先生产出质量良好的多糖疫苗和蛋白载体，再通过化学反应生产多糖蛋白结合疫苗。因此多糖质量、蛋白载体质量和多糖蛋白结合率均应作为多糖蛋白结合疫苗的质量控制指标。多糖疫苗的质量控制常常通过测定糖单元含量和多糖分子量分布实现，目前报道的多糖糖单元含量测定方法有衍生-紫外分光光度计法和LC-MS/MS法，多糖分子量分布可用SEC-MALLS测试。单一蛋白载体质量如纯度和含量可使用ELISA或Lowry法测试。多糖与蛋白结合位点的结合率也与多糖蛋白结合疫苗的质量息息相关。对破伤风类毒素和白喉类毒素为载体蛋白的多糖蛋白结合疫苗，其质量还受载体蛋白脱毒工艺的影响。虽然载体蛋白的脱毒、多糖蛋白结合位点的结合率直接影响着多糖蛋白结合疫苗质量，但尚无测试方法报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，可以用于测定以破伤风类毒素为载体的4价脑膜炎疫苗、以破伤风类毒素为载体的Hib疫苗、以破伤风类毒素为载体的13价肺炎疫苗、以CRM197蛋白为载体的13价肺炎疫苗、以CRM197蛋白为载体的4价脑膜炎疫苗、以CRM197蛋白为载体的Hib疫苗中多糖蛋白结合位点的多糖蛋白结合率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，所述多糖蛋白结合疫苗是以破伤风类毒素(即甲醛脱毒的破伤风蛋白)或CRM197蛋白为载体的疫苗，包括以下步骤：

(1)标准品的酶解：取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂使蛋白变性；加入二硫键断裂试剂使二硫键断裂；加入碘代乙酰胺溶液；加入胰蛋白酶酶解，得蛋白酶解液；

(2)固相萃取富集目标肽段：蛋白酶解液通过固相萃取柱，得含目标肽段的蛋白洗脱液；

(3)高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析蛋白洗脱液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应，计算各特征肽段峰的峰面积；