[发明专利]一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用

说明书

本发明涉及一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用，属于生物工程领域。该噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC NO:M 2019276，保藏日期为2019年4月19日，该噬菌体对粪肠球菌有强的裂解作用。在本发明中，该噬菌体从电镜形态上分析，属于典型的有尾噬菌体，肌尾科噬菌体，将其命名为粪肠球菌噬菌体PEf771；噬菌体PEf771感染温度范围在20～42℃；噬菌体PEf771在pH 4～8均有70％以上活性，噬菌体PEf771热稳定性不佳，不能耐受60℃以上长时间高温。采用本发明的噬菌体能特异性裂解粪肠球菌。在应用实例也证实，该噬菌体可用于由粪肠球菌引起的细菌感染，作为抗生素的替代品，安全有效的维护口腔微生态。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用，尤其涉及一种难治性根尖周炎粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用。

背景技术

噬菌体是一类以原核微生物为宿主的病毒，被发现广泛存在于自然环境中，种类复杂多样，地球上约有10³⁰～10³²个噬菌体，其数量相当于细菌的十几倍甚至几十倍。几乎每一个细菌都有其对应的噬菌体。噬菌体结构简单，仅由衣壳蛋白和其内部的遗传物质组成，缺乏独立代谢能力，依靠宿主细胞的核糖体、蛋白质来合成自身生长和增殖所需的各种因子、各种氨基酸和能量。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制，进入静止期。

口腔疾病中牙髓炎和根尖周炎发病率高，根管治疗术是治疗根管内感染的首选的方法。通过根管预备、消毒和充填等步骤能有效清除根管内的感染源，阻止病变的发生发展，促进根尖周病灶的愈合。但是临床上有部分患者经过反复多次规范根管治疗后仍出现根尖周脓肿和进行性骨质破坏，导致牙槽骨缺损和牙齿丧失，即难治性根尖周炎。严重影响患者的生存质量，是牙髓病临床治疗的新难点，也是口腔医师面临的棘手问题。研究表明，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是根管治疗后再感染和难治性根尖周炎的主要病原菌，甚至是唯一检出细菌，因此，控制粪肠球菌感染在根管治疗中十分重要，彻底清除粪肠球菌感染是提高难治性根尖炎治愈率的关键。噬菌体能特异性与宿主细菌结合，而且只感染原核细胞，不感染真核细胞，对人和动物无害，为控制难治性根尖周炎粪肠球菌感染提供了一种有效快捷的解决方法。噬菌体因其高效的杀菌能力及高度的宿主专一性而成为新一代抗菌制剂的候选。具有潜在的开发价值。

发明内容

本发明提供了一种粪肠球菌噬菌体及其分离、纯化、富集和应用，旨在口腔疾病中牙髓炎和根尖周炎发病率高，以及粪肠球菌面临的耐药性问题。

本发明的目的在于提供一种粪肠球菌噬菌体，该噬菌体保藏于：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏号为:CCTCC NO:M2019276，保藏日期为2019年4月19日，该噬菌体对粪肠球菌有强的裂解作用。在本发明中，该噬菌体从电镜形态上分析，属于典型的有尾噬菌体，肌尾噬菌体科(Myoviridae)，将其命名为粪肠球菌噬菌体PEf771；噬菌体PEf771感染温度范围在20～42℃；噬菌体PEf771在pH4～8均有70％以上活性，噬菌体PEf771热稳定性不佳，不能耐受60℃以上长时间高温。

一种粪肠球菌噬菌体的分离、纯化以及富集方法，其特征在于，该方法步骤如下：

1、宿主菌的准备：以粪肠球菌E.faecalisYN771作为分离噬菌体的宿主菌，该菌株于2019年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M 2019275，将粪肠球菌YN771，在BHI固体培养基上划线，32～40℃恒温孵育20～30h，然后挑取单菌落接种于5mL BHI液体培养基中，培养至对数生长早期OD为0.3，供分离粪肠球菌噬菌体用；