[发明专利]一种发酵合成α-红没药醇的工程菌株及其构建方法

说明书

本发明公开了一种发酵合成α‑红没药醇的工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为宿主，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS为表达载体，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌引入将不同来源的BBS基因和不同来源的ispA基因进行不同组合的优化表达，再进行密码子优化、RBS优化、启动子优化等策略，实现了高效生物合成α‑红没药醇。本发明为微生物系统高效发酵制备(﹣)‑α‑红没药醇奠定了基础，适合于工业化生产应用。

技术领域

本发明涉及一种发酵合成α-红没药醇的工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

α-红没药醇，又称甜红没药醇、防风根醇，是自然界中存在较多的倍半萜化合物之一，有α-体和β-体两种结构。(﹣)-α-红没药醇主要存在于春黄菊精油中，含量达17％，其右旋体存在于胶杨精油以及某些苦槛蓝属和鼠尾草属的精油中。红没药醇具有降低皮肤炎症、抑菌抗刺激、活血止痛、愈合溃疡、溶解胆石等多种生物活性，因此它可以作为活性成分用于皮肤化妆品或抑制皮肤炎症，以保护和护理过敏性皮肤等，在医药行业中的用途较广。此外，红没药醇香气清淡愉快，也是一种稳定性较好的定香剂，在香料香精化妆品中的应用也日益受到重视。

红没药醇作为次级代谢产物，天然产量有限，若采用直接提取方法获取，不仅产量少而且会危及生态和环境安全，甚至造成濒危植物消失。红没药醇有复杂手性化学结构，若采用化学方法则化学合成难度高，纯度低，生物活性差。因此，利用生物构工程菌实现以廉价的碳源和培养基生产具有高附加值和广泛用途的红没药醇是一条最具有潜力的途径。

然而，现有的报道中，通过构建基因工程菌生产红没药醇的方法，其效果并不理想。如Gui Hwan Han等通过三个步骤来构建产红没药醇基因工程菌，(1)将德国洋甘菊(﹣)-α-红没药醇合成酶基因(MrBBS)引入大肠杆菌；(2)设计了外源性MVA途径以增加红没药醇前体库；(3)过表达ispA基因，该基因有效地提供(﹣)-α-红没药醇前体(FPP)。但该过程繁琐，需引入一整条外源途径，且产量仅为80mg/L。(Han G H,Kim S K,Yoon K S,etal.Fermentative production and direct extraction of(-)-α-bisabolol inmetabolically engineered Escherichia coli[J].Microbial Cell Factories,2016,15(1):185.)。

因此，提供一种高效生物合成红没药醇的方法，对于工业生产红没药醇具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种发酵合成α-红没药醇的工程菌株，是以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，同时表达了BBS基因和ispA基因，所述ispA基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.14任一所示，所述BBS基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或SEQID NO.16所示，或，表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.19任一所示的蛋白质。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌W3110或大肠杆菌BL21。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌W600或枯草芽孢杆菌W800。

在本发明的一种实施方式中，所述ispA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.3任一所示。

在本发明的一种实施方式中，所述BBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5所示。