[发明专利]基于Sanger测序法对Pax1基因启动子区甲基化多位点的检测方法

说明书

本发明涉及一种基于Sanger测序法对Pax1基因启动子区甲基化多位点的检测方法，本发明设计的pax1基因启动子区扩增引物分为两对，一对是甲基化扩增引物，一对是非甲基化扩增引物，扩增片段大小在150bp左右，片段包含了9个甲基化位点，扩增后配合ABI3720xl测序平台进行Sanger测序。本发明提供的方法能够一次测序可以拿到PAX1启动子区9个位点的甲基化情况结果，而现有Pax1探针法专利大多只检测一个位点，提供信息有限；Sanger测序的周期很短，比二代测序短5‑7天，和qPCR探针法相当；PCR加Sanger测序实验操作容易，测序结果判读直接一目了然，不需要数据分析经验。

技术领域

本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及一种基于Sanger测序法对Pax1基因启动子区甲基化多位点的检测方法。

背景技术

宫颈癌指的是发生在宫颈部与子宫颈阴道的一种恶性肿瘤，属常见妇科肿瘤，发生率仅次于乳腺癌。全世界每年有20万人因宫颈癌死亡，国内每年将近5万人因为宫颈癌而死。HPV病毒感染为宫颈癌发生以及发展的重要因素，大约有90％的宫颈癌患者存在HPV感染。目前临床上常用的宫颈癌筛查方法包括细胞学检查(TCT)、HPV分型检测。

宫颈癌虽是恶性肿瘤，但它的发生和发展有一个渐进的演变过程，时间可以从数年到数十年，一般认为这个演变过程经过这样几个阶段：轻度、中度和重度上皮内瘤样病变、早期浸润癌、浸润癌。癌前病变是指临床上经过组织病理检测的三个分期，轻度(CIN1)，中度(CIN2)，重度上皮内瘤样病变(CIN3)。癌前病变临床分期的准确评估对病人的治疗至关重要，但是常规的病理组织检测金标准需要手术锥切取组织进行检测，对患者有创伤，而且还有成本较高，操作难度大，报告周期长等缺点。临床亟需一种快速准确而且创伤小的癌前病变CIN2+筛查手段。

DNA甲基化是一种重要的表观修饰，它在不改变DNA序列的情况下，对基因表达模式以及基因组的稳定性起重要的调控作用。PAX1基因是抑癌基因，它的正常功能是调控细胞分化，但该基因发生甲基化，将无法与转录因子结合，其表达会下降、甚至沉默，细胞分化功能受阻，细胞增殖等。多数研究显示PAX1基因甲基化水平随宫颈病变严重程度的增加而升高，可以作为宫颈癌及癌前病变筛查的生物学标志物。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于Sanger测序法对Pax1基因启动子区甲基化多位点的检测方法，按照先后顺序包括以下步骤：

(1)将临床宫颈脱落细胞样本进行DNA提取，对提取的DNA进行浓度测定；

(2)提取后的DNA进行重硫酸盐转化，反应后体系经过清洗纯化去重硫酸盐最后得到纯净的转化产物，直接用于下一步扩增；

(3)将Multiplex PCR master mix、正向引物、反向引物、转化产物和无核酸水组成PCR体系进行PCR扩增；

(4)将PCR产物纯化后进行测序。

优选的是，步骤(3)中，所述正向引物和反向引物的名称以及序列为：

pax1-2F(M)GAATTAATGAGTTGTTAATTCGCGCGT

pax1-2R(M)CCGATTAAAAAAAATTCGTCTAACCGAA

pax1-2F(U)GGGAATTAATGAGTTGTTAATTTGTGTGT

pax1-2R(U)CCAATTAAAAAAAATTCATCTAACCAAA。

在上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，DNA提取选用Qiagen公司的QIAampBlood Mini试剂盒，DNA浓度测定使用的荧光定量仪的型号为Qubit 3.0。