[发明专利]一种长效重组人促卵泡激素及其制备方法和应用

说明书

本发明提出了一种重组hFSH‑Fc融合蛋白，所述融合蛋白为二聚化融合蛋白，其中一个单体氨基酸序列从N端到C端依次为hFSHβ亚基、CTP、CTP和hFSHα亚基；另一个单体氨基酸序列从N端到C端依次为CTP、hFSHα亚基、hFSHβ亚基和CTP。本发明将两个CTP连接到FSH的编码序列上，避开对受体结合或生物活性重要的区域，不影响受体结合亲和力，不具有免疫原性，可显著延长体内寿命。同时，FSH‑CTP在体内的半衰期更长，终末半衰期是重组FSH‑WT的2‑3倍，且可以以一周一次注射代替每天7次注射，生物活性更高。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种长效重组人促卵泡激素。

背景技术

目前，世界范围内不孕症率高达15％，成为继癌症和心脑血管疾病之外，严重影响人类健康的第三大疾病。我国不孕症人数占生殖妇女人数10％以上，且其发病率呈明显上升趋势。人促卵泡素(Human follicle-stimulating hormone，简称hFSH)是目前市场常见的用于治疗男女不孕症药物的主要成份。

人促卵泡素(Human Follicle-stimulating hormone，简称hFSH)是一种由脑垂体前叶分泌的促性腺激素，是男性和女性正常生殖功能所必需的。卵泡刺激素与促黄体素(LH)、人体绒毛膜促性腺激素(hCG)、促甲状腺素(TSH)共同组成糖蛋白激素家族。这些激素是由两个亚基形成，α和β，α亚基是普遍的,β亚基是特定的。促卵泡激素在临床上用于刺激卵巢卵泡发育进行体外受精，以获得更多的卵母细胞。在男性中，FSH被发现对调节和维持精子形成过程至关重要。在使用FSH后，后精子超微结构和运动能力明显改善。促卵泡素之前从老年妇女的尿液中纯化用于临床。然而,识别FSHβ和α基因使得DNA技术能够在哺乳动物细胞中产生重组FSH而为人类使用。

由于FSH的半衰期相对较短，因此它以前是每天注射的。因此，有必要开发长效重组FSH(rhFSH)，以减少给药次数。为了克服这个问题，其他研究人员描述了一种增加rhFSH半衰期的方法，即通过位点定向突变引入新的n-连锁糖基化位点。结果表明，添加n-连锁碳水化合物链并不影响激素的折叠或与受体的结合亲和力，同时，增加了动物模型的半衰期和体内生物活性。但是，这种策略可能会改变FSH的结构，并在体内触发免疫反应。这些类似物未在临床研究中进行检测，其免疫原性谱尚不清楚。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供一种长效重组人促卵泡激素及其制备方法和应用，其目的在于，提供一种长效重组人促卵泡激素，通过将包含4个O-linked寡糖位点的CTP肽连接到FSH亚基的编码序列，用哺乳动物表达载体将此结构与α亚单位联合转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中，产生二聚体重组激素，该结合对亚基的组装、蛋白质的折叠、受体结合亲和力和体外生物活性无影响。

本发明提供一种重组hFSH-Fc融合蛋白，所述融合蛋白为二聚化融合蛋白，其中一个单体氨基酸序列从N端到C端依次为hFSHβ亚基、CTP、CTP和hFSHα亚基；另一个单体氨基酸序列从N端到C端依次为CTP、hFSHα亚基、hFSHβ亚基和CTP；

所述hFSHβ亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述CTP的氨基酸序列如SEQID NO:2所示；所述hFSHα亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明进一步保护一种上述重组hFSH-Fc融合蛋白的制备方法，包括：利用重叠聚合酶链反应构建CTP序列与FSHβ亚基的嵌合基因；将嵌合基因克隆到含有LTR/CMV启动子的真核表达载体中；将构建的含FSHα亚基和FSHβ亚基的载体联合转染到中国仓鼠卵巢细胞中，筛选出稳定表达的细胞株；收集来自稳定表达的细胞株的培养基中的FSH变异体，并纯化得到重组hFSH融合蛋白

作为本发明进一步的改进，所述嵌合基因的构建包括如下步骤：S1.构建FSHβ-CTP；S2.构建FSHβ(CTP)2；S3.CTP-α嵌合基因的构建。