[发明专利]一种印楝细胞悬浮培养基及细胞悬浮培养方法

说明书

本发明提供了一种印楝细胞悬浮培养基及细胞悬浮培养方法。所述印楝细胞悬浮培养基是在基本培养基的基础上优化组分配比，并添加了一定量的钒酸钠、L‑半胱氨酸、酪氨酸、烟酰胺、二硫苏糖醇、β‑D‑半乳糖、环己六醇磷酸酯、胺鲜酯、6‑BA、蜕皮激素、硝普钠、二辛基磺基琥珀酸钠、辣蓼草汁和地黄连汁；所述细胞悬浮培养方法包括以下步骤：1）无菌试管苗的获得，2）愈伤组织诱导与继代培养，3）细胞悬浮培养。应用本发明的培养基及培养方法不仅能获得稳定的印楝细胞悬浮培养体系，还能显著提高悬浮细胞的生物量和印楝素含量，为印楝细胞规模化培养生产印楝素提供了技术支撑，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种印楝细胞悬浮培养基及细胞悬浮培养方法。

背景技术

印楝（学名：Azadirachta Indica A.Juss.）是楝科印楝属植物，主要分布在东南亚热带地区，在我国广东、海南、四川和云南均有引种栽培，是一种喜高温、耐干旱、喜阳光充足、耐土壤贫瘠且生长迅速的热带或亚热带乔木树种。印楝是世界上公认的理想杀虫植物，以其独特的杀虫效果和高效的杀虫、拒食、趋避、毒杀和抑制生育能力等活性居于植物源农药资源的首位。印楝的果实、种子、种核、枝条、树叶、树皮及树液中都含有活性物质，但以种子尤甚。迄今，印楝中已发现了100多种化合物，至少有70种化合物具有生物活性，它们为二萜类、三萜类、戊三萜类和非萜类化合物，其中最主要的活性成分是印楝素。大量研究结果表明，印楝素对小菜蛾、菜青虫、蝗虫等10余目400多种农、林、仓储和卫生害虫有杀虫活性，对多种线虫和真菌也具有很好的杀灭作用，同时具有害虫不易产生抗药性、持效时间长、在环境中很容易降解及对高等及温血动物无毒等特点，是当前世界各国研究最多、被世界公认的广谱、高效、低毒、低残留的环境友好新型杀虫剂。

目前，印楝素的来源主要是从印楝植物的种子中提取，但是种子收获具有季节性，且易于变质，随着储存时间的延长，其中的印楝素含量逐渐降低。多种外界因素如光照、降雨、施肥、地理位置等也对种子中印楝素含量有重要影响。此外，印楝适合生长在热带或亚热带，因此在我国的栽培受到限制，无法在全国范围内推广种植，而随着市场需求的不断扩大，从印楝植物中直接提取印楝素已不能满足需要，必须寻求更多更可靠的材料来源。

植物细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中，通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮状态的培养方法。一个好的细胞悬浮培养体系具有以下特点：一是悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成，但很少完全由单细胞组成；二是均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒；三是生长迅速，悬浮细胞的生物量一般2-3d甚至更短的时间便可增加一倍。植物细胞悬浮培养作为现代生物技术领域的一个重要分支，以其不受外界环境影响、生长周期短、繁殖规模大、产物均一可控的优点被广泛应用于细胞学、发育生物学、分子生物学以及生产次生代谢产物等。因此，建立优良的植物细胞悬浮培养体系成为重要的基础研究工作之一。

虽然用植物细胞悬浮培养的方式生产次生代谢物与从天然植株中直接提取或化学合成法相比具有不可比拟的优势，但目前为止植物细胞悬浮培养实现商业化应用的例子非常少，其中一个很重要的原因就是培养过程中目标产物的产量太低。而在植物细胞悬浮培养的过程中，培养条件和营养条件是影响细胞生长代谢的重要因素，其中培养条件是指温度、光照、pH、溶氧等环境条件的控制，而营养条件主要指植物细胞的培养基。由于在封闭培养环境中培养基是植物细胞的唯一营养来源，因此培养基的成分对植物细胞的生长水平、代谢产物类别具有极其重要的影响，尤其对于以获得特定代谢产物为目的的细胞培养而言，培养基往往是影响培养效率的关键因素。