[发明专利]一种在H11位点条件性过表达Yap1基因小鼠模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种在H11位点条件性过表达Yap1基因小鼠模型的构建方法，构建方法为：先获得可诱导型Yap1过表达转基因载体；再获得转基因F0代小鼠；然后F0代小鼠与野生型小鼠交配，传代建系，获得F1代小鼠，阳性F1代小鼠扩繁后进行互配，即得条件性过表达小鼠Yap1动物模型。本发明构建得到的转基因小鼠模型可研究Yap1在不同组织、不同发育时期的功能及Hippo信号通路的作用机制，并可以研究Hippo信号通路在动物发育、生物肿瘤发生及再生医学等多学科中的作用，对生物体信号传导研究有着重要的指导意义。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在H11位点条件性过表达Yap1基因小鼠模型的构建方法。

背景技术

复杂的生物过程通常需要进行体内分析，而人体内生物学的研究受到道德和技术的严重限制，因此越来越需要动物模型来进行人体细胞、组织和器官的体内研究。

经过二十年的研究，在多种模式生物体中均已经确定Hippo信号通路是发育过程中调节器官大小和组织稳态的关键因子。通过抑制YAP和TAZ转录共激活因子，Hippo通路可调节细胞增殖，凋亡和细胞干性，通过响应广泛的细胞外和细胞内信号，包括细胞与细胞接触，细胞极性，机械信号，G蛋白偶联受体的配体以及细胞能量状态等。同时，Hippo信号通路的异常调节对癌症发生发展产生显着影响。进一步研究该途径的功能和调节机制将有助于揭示器官大小控制的神秘面纱，并确定癌症治疗的新靶标。

多细胞生物的出现是进化的里程碑，其中支持多细胞生物的最基本机制中包括确保组织和器官的适当大小和形状以满足生理功能需求。然而，尽管对“预设”大小的器官背后的基本原理进行了深入研究，但对发育生物学中的这个基本问题尚未有清晰的了解。

Hippo信号通路因其在调节器官大小方面具有重要作用，同时还在组织再生和癌症的发生发展有明显相关性而迅速基础科研的引起广泛关注。

利用基因编辑技术，在动物模型中条件性过表达Yap1蛋白，可用于研究Yap1的功能及Hippo信号通路的作用机制。以啮齿类动物为例，小鼠体内进行条件性过表达Yap1蛋白，可以用来研究Hippo信号通路在动物发育生物、肿瘤发生学及再生医学等多学科中的作用。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种在H11位点进行条件性过表达小鼠Yap1动物模型的构建方法，可用于研究Yap1的功能及Hippo信号通路的作用机制。该位点已被证实既无内源基因，又不会使表达沉默，是绝佳的基因敲入位点。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种在H11位点条件性过表达Yap1基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：根据Yap1基因的序列，设计合成sgRNA序列；

S2：以puc57-sgRNA质粒为模板，PCR扩增获得sgRNA转录模板，并经过体外转录得到sgRNA；将得到的sgRNA与Cas9蛋白共同孵育，得Cas9/sgRNA混合物；

S3：根据S2得到的sgRNA设计、构建携带条件性过表达Yap1序列的线性化的条件性过表达Yap1打靶载体；所述打靶载体利用同源重组技术构建，构建过程中所用到的重组系统为Cre-LoxP和Dre-rox双重诱导表达系统，打靶载体包括CAG-loxP-rox-Stop-loxp-rox-mYap1-P2A-mCherry基因片段；

S4：将S3得到的打靶载体与Cas9/sgRNA混合物混合后，转移至0.5天的小鼠受精卵中，再将受精卵转移至0.5天的假孕雌鼠体内，出生的小鼠即为F0代小鼠；

S5：将S4得到的F0代小鼠与野生型C57BL/6J小鼠配繁获得F1代小鼠，阳性F1代小鼠扩繁后进行互配，获得条件性过表达小鼠Yap1动物模型。

本发明的有益效果是：