[发明专利]一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽及其应用

说明书

本发明公开了一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α‑factor信号肽及其应用。本发明对具有如SEQID NO:1所示氨基酸序列的毕赤酵母GS115 α‑factor信号肽引入一个N糖基化位点，得到优化后的毕赤酵母GS115交配外激素α‑factor信号肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本发明优化的α‑factor信号肽特别适用于引导外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，与优化前信号肽相比，表达水平提高了5‑7倍，其应用有利于筛选到高表达菌株，具有降低生产成本、便于后续纯化等优势。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽及其应用。

背景技术

近年来，随着生活水平提高，健康意识增强，人们对各种治疗或保健用蛋白类药物（如疫苗、免疫球蛋白、抗体和蛋白质因子等）的需求逐年攀升。然而，许多药用蛋白无法通过天然材料的分离纯化获取，必需利用外源蛋白系统进行表达。

现有的外源蛋白表达系统中，原核生物体系虽然遗传操作简单、培养成本低廉且产物表达高，但不能对外源蛋白进行翻译后修饰。真核生物体系对表达的外源蛋白能进行翻译后加工修饰，因此得到的产物与原核生物体系相比通常具有较高的生物活性。作为单细胞真核生物的毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统由于其兼具真核生物和原核生物的特点，在研究需要加工修饰的分泌性蛋白时倍受科研人员青睐。大多数分泌性蛋白具有重要的生理调节功能，如肽类荷尔蒙、神经多肽、胰岛素及其受体、生长和分化因子、细胞表面受体、胞外金属蛋白酶、凝血因子、粘附分子、血浆蛋白等，其中相当大一部分是药用蛋白候选或已经是成功的蛋白药物。

利用毕赤酵母表达外源分泌蛋白时，需要有一条信号肽引导外源蛋白进入分泌通道，最终蛋白才能得以分泌到细胞外。信号肽的效率决定了外源蛋白分泌表达。因此，开发一条在毕赤酵母中能高效分泌蛋白到胞外的信号肽对外源蛋白的分泌表达至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种优化的毕赤酵母GS115交配外激素α-factor信号肽及其应用，该优化后的信号肽在毕赤酵母中可以高效的引导外源蛋白分泌。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

首先，本发明分析毕赤酵母GS115基因组序列，从中找到一条α-factor基因，从中得到α-factor基因信号肽，所述α-factor信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，编码该α-factor信号肽的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。

所述的α-factor信号肽可以引导目的蛋白的分泌表达。

进一步的，通过对所述的α-factor信号肽的氨基酸序列引入一个N糖基化位点，得到优化的α-factor信号肽，所述优化的α-factor信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，编码该优化的α-factor信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。

所述的N糖基化位点可以引入到毕赤酵母GS115 α-factor信号肽的任何位置，引入的N糖基化位点数可以是1个，也可以是多个。在本发明中N糖基化位点数位点位于第113位氨基酸。

所述优化的α-factor信号肽可以高效引导外源蛋白的分泌表达。

所述的外源蛋白可以为任意蛋白质，在本发明中为绿色荧光蛋白。

本发明优化的α-factor信号肽可以添加于毕赤酵母胞内表达载体，用于引导外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达。

所述的胞内表达载体可以是以下任意一种：pGAPA,BC，pAO815，pPIC3.5K，pPIC3.5，pFLD1和pPICZA,BC。在本发明的实施例中，所用的胞内表达载体是pPICZA。