[发明专利]一种ω-转氨酶双突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种ω‑转氨酶双突变体及其应用，该ω‑转氨酶双突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明ω‑转氨酶双突变体由野生型的土曲霉(Aspergillus terreus)ω‑转氨酶第115位的苯丙氨酸突变成亮氨酸，第118位的亮氨酸突变成苏氨酸而获得；该ω‑转氨酶双突变体的半失活温度比野生型提高了8.8℃，热解折叠温度比野生型提高了7.7℃，在40℃时的半衰期较野生型延长了59.0min，是野生型的9.55倍。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种ω-转氨酶双突变体及其应用。

背景技术

胺转氨酶(ATAs)以其高立体选择性和环境温和的反应条件，成为制备光学纯手性胺最主要的生物催化剂。一般来说，提高温度可以增加原料与产物的溶解度降低其粘度，加快反应速度，但天然状态下的酶的温度耐受性差，高温易使酶失活变性，如何提高酶的热稳定性是蛋白质工程极具挑战性的研究。

由Michael Smith发明兴起的定点突变技术，是在已知的基因序列中插入、取代和缺失特定核苷酸，从而改变蛋白质一级结构。张晓凤等(张晓凤.定点突变提高土曲霉Aspergillus terreus脂肪酶的催化活性[J].生物工程学报,2018,34(7):1091-1105)对酸性脂肪酶底物结合口袋附近和Lid区域的位点进行突变，获得了催化活性显著提高的ATLV218W和ATL Lid突变体。

定点饱和突变技术提升了点突变的可能性，能将某个预测功能位点同时替换成其它19种氨基酸。通过设计简并引物构建饱和突变文库因突变子数量庞大需要简单灵敏的高通量筛选方法以获得有效突变体。例如：林玲等(林玲.利用定向进化及半理性设计提高谷氨酸脱羧酶催化活性的研究[D].浙江:浙江大学,2013)对GAD1407谷氨酸脱羧酶的第51位点构建饱和突变文库，并采用郁凯等(Yu K,Hu S,Huang J,Mei L H.A high-throughputcolorimetric assay tomeasure the activity of glutamate decarboxylase[J].Enzyme Microb.Technol,2012,49(3):272-276)根据溴甲酚紫指示剂能反映谷氨酸脱羧酶催化底物脱羧引起体系pH值变化，而建立了通过观察颜色的深浅来判断谷氨酸脱羧酶活性高低的高通量筛选方法，最终筛选获得突变体Q51H，其催化活性是野生型的2.2倍。

申请公布号为CN109486778A的发明专利申请公开了一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用，该ω-转氨酶突变体的第118位氨基酸由亮氨酸突变为丙氨酸或苏氨酸，与野生型相比，ω-转氨酶突变体的半失活温度提高3.7℃和5.3℃，半衰期延长13.7min和19.1min。

然而，单突变位点的突变对酶活稳定性的改善是有限的，为了进一步的提高转氨酶的热稳定性，需要在其他位点引入突变。

发明内容

本发明提供了一种ω-转氨酶双突变体，在利用蛋白质共进化网络预测高交联残基位点的基础上，结合迭代饱和突变技术，构建迭代饱和突变文库，筛选获得双突变体L118T-F115L，该双突变体的T_m和T₅₀¹⁰相比于野生型分别提高了7.7℃和8.8℃，其40℃时的t_1/2较野生型延长了59.0min。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种ω-转氨酶双突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述双突变体是由野生型的土曲霉(Aspergillus terreus)ω-转氨酶第115位的苯丙氨酸(密码子TTT)突变成亮氨酸(密码子CTA)，第118位的亮氨酸(密码子TTG)突变成苏氨酸(密码子ACG)而获得的，称为L118T-F115L双突变体。