[发明专利]原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢研究中的应用

说明书

本发明提出一种原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢研究中的应用，属于细胞生物学领域，该技术方案通过设计试验方法检测该共培养体系，可在细胞层面明确神经元铁的来源、其与星形胶质细胞间的相互影响，以及铁转运的方向性问题。本发明建立的原代星形胶质细胞与原代中脑腹侧神经元共培养体系是一种新的研究帕金森病的细胞模型，可用于研究帕金森病等神经退行性疾病脑内高铁的相关研究中。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，尤其涉及一种原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢研究中的应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种多发于中老年的第二大神经系统退行性疾病，其病理学特征为黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元缺失。近年来，脑内高铁导致黑质－纹状体系统DA能神经元功能的损伤已成为越来越受到神经科学家关注的热点问题。目前PD铁沉积的研究主要集中在DA能神经元，铁负载时，神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞有铁沉积，而星形胶质细胞却在同样的情况下没有铁沉积。那么，星形胶质细胞在脑铁代谢以及PD黑质铁聚积过程中是如何发挥作用的是进一步研究PD病人中脑内高铁以及铁沉积分布区域不同的关键。

目前，研究星形胶质细胞和DA能神经元铁转运的研究方法，主要是利用激光共聚焦显微镜，与钙黄绿素结合，实时观察铁转入细胞与转出细胞的速率。此种方法虽然可以高效实时观察其铁转运速率的变化，但无法研究星形胶质细胞对神经元铁转运的影响，无法确定神经元中过多的铁的来源，也无法确定不同细胞中的铁含量。星形胶质细胞与神经元间铁转运是如何相互影响的，铁沉积的铁的来源，各细胞中铁含量等仍是目前亟需探讨的关键问题。

在神经科学领域，目前应用星形胶质细胞和神经元共培养体系的研究主要集中在神经元突触的发育，细胞的迁徙、浸润，形态学及代谢产物的研究，且主要集中在海马和皮层星形胶质细胞和神经元的研究。并且，在中脑及帕金森病中的研究较少，且主要集中在了神经炎症对多巴胺能神经元的损伤、凋亡等的研究和星形胶质细胞的神经保护因子的保护作用，而在铁代谢中的研究较少。在体外研究中，并未见利用原代培养的星形胶质细胞和中脑腹侧 (ventral mesencephalon,VM)神经元共培养系统用于铁转运的相互影响，及铁代谢的相关研究报道。

因此，构建中脑原代培养的星形胶质细胞和VM神经元共培养系统，建立一种新型的帕金森病的细胞模型，以在细胞层面明确神经元铁的来源、其与星形胶质细胞间的相互影响，以及铁转运的方向性对于本领域而言尤为重要。

发明内容

本发明提出一种原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢研究中的应用，通过设计试验方法检测该共培养体系，可在细胞层面明确神经元铁的来源、其与星形胶质细胞间的相互影响，以及铁转运的方向性问题。

为了达到上述目的，本发明提供了一种原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢中的应用。

作为优选，包括以下步骤：

利用10μM 6-OHDA分别预孵育接种于Transwell上室的原代培养的星形胶质细胞和接种于Transwell下室的原代培养的中脑腹侧神经元24h；然后利用1mM外源性铁FAC继续孵育接种于Transwell上室的原代培养的星形胶质细胞30min；

将上室的原代培养的星形胶质细胞的培养基和下室的原代培养的中脑腹侧神经元的培养基同时更换为原代培养的中脑腹侧神经元的完全培养基，并将上室放入下室的孔板中共培养30min，检测原代培养的星形胶质细胞和中脑腹侧神经元中Fe²⁺的含量。

作为优选，将上室放入下室的孔板中对原代培养的星形胶质细胞和原代培养的中脑腹侧神经元进行共培养前还包括共培养体系建立的步骤，具体包括以下步骤：