[发明专利]一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法

权利要求书

1.一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法，其特征在于：

(1)蓖麻毒素蛋白A链编码基因的克隆：以蓖麻籽抽提获得的总RNA为模板，利用RT-PCR系统一步克隆获得蓖麻毒素蛋白A链基因的PCR产物；

(2)含有蓖麻毒素蛋白A链基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶BamHI和HindIII消化PCR2.1-蓖麻毒素蛋白A链得到蓖麻毒素蛋白A链基因片段，然后将蓖麻毒素蛋白A链基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisA获得重组体pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A链；通过共转染在家蚕培养细胞BmN内将重组体pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A链与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的基因同源重组产生重组病毒；

(3)家蚕体内表达重组蓖麻毒素蛋白A链：使用家蚕幼虫5龄起蚕，经口接种上述重组病毒进行感染表达，将涂布有病毒液的桑叶饲喂家蚕，然后在23-25℃下饲养；在饲养96小时后收集家蚕幼虫；从家蚕幼虫中收集血淋巴，用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，获得最终的重组蓖麻毒素蛋白A链蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，利用RT-PCR系统一步克隆具体如下：引物设计如下：正向引物：5'-AGGGATCCCCATTCCCCAAATA-3'，含有BamHI酶切位点，反向引物：5'-GAAGCTTTAAAAACTGTGACGATGGT-3'，含有HindIII酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下：一个循环，94℃模板变性2分钟；10个循环，94℃变性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟；25个循环，94℃变性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟；最后1个循环，68℃延伸7分钟；然后利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用PCR纯化试剂盒纯化，随后将PCR产物克隆入载体PCR2.1，获得PCR2.1-蓖麻毒素蛋白A链。

3.根据权利要求1所述的一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，载体PCR2.1为Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体PCR2.1。

4.根据权利要求1所述的一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为：在离心管中加入1μg的pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A链DNA和15μg的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)DNA，混匀，并加入14μl的脂质体(lipofectin)，再加入灭菌蒸馏水至终体积40μl，获得混合物；然后将混合物在常温培育15分钟后共转染对数生长期的BmN培养细胞，用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基在27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，用病毒储存原液通过空斑筛选，最终获得重组病毒溶液，浓度为10⁸pfu/ml。

5.根据权利要求1所述的一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，以家蚕幼虫的血淋巴作为重组蓖麻毒素蛋白A链纯化的起始材料，具体使用以下方法从家蚕幼虫中收集血淋巴：收集管预先加入占据收集管1/10体积的10mmol/L的二硫苏糖醇DTT(分子式为C4H10O₂S₂)，在收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边；用25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中。

6.根据权利要求1所述的一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，具体为：将收集的血淋巴用非变性结合缓冲液进行稀释，非变性结合缓冲液含有Na₃PO₄ 50mmol/L、NaCl 0.5mol/L且pH8.0，稀释后将溶液结合于Ni-NTA亲和柱，再在非变性结合缓冲液中加入250mmol/L咪唑获得非变性洗脱缓冲液，用非变性洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液作为重组蓖麻毒素蛋白A链蛋白的溶液。