[发明专利]一种通用的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法

说明书

本发明提供一种通用的短串联重复序列等位基因阶梯的制备方法，其包括如下步骤：(1)根据STR基因座设计并合成引物及质粒；(2)采用引物，以质粒作为扩增模板，进行PCR扩增反应；(3)对PCR扩增产物进行纯化，适当稀释后获得STR等位基因阶梯。本发明仅需要合成1个质粒、1次PCR反应，对PCR产物进行纯化稀释后即可得到相应STR基因座的allele ladder，大大简化了STR基因座allele ladder的制备流程、制备的人力成本、时间成本与经济成本。

技术领域

本发明涉及于基因工程技术领域，尤其涉及一种通用的短串联重复序列(STR)等位基因阶梯((Allele Ladder)的制备方法及其试剂盒。

背景技术

在人以及各种基因组中均存在一种称为短串联重复序列(short tandem repeat，STR)的遗传标记。STR广泛应用与遗传学、法医学、肿瘤学等方面的研究，尤其是那些在人群中具有高度多态性的STR遗传标记。如Dib C与其同事于1996年(Nature.1996 Mar 14；380(6570):152-4.PMID:8600387)、Broman KW等于1998年(Am J Hum Genet.1998Sep；63(3):861-9.PMID:9718341)、Kong A等于2002年(Nat Genet.2002Jul；31(3):241-7.PMID:12053178)分别采用5236个、8325个、5136个STR遗传标记进行了高分辨的人类基因组遗传作图。在法医学领域，STR标记更成为进行个体识别与亲权认定的标准遗传标记，国际上如美国应用生物系统公司(ThermoFisher公司子品牌，https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/industrial/forensics/human-identification.html)、Promega公司(https://www.promega.com.cn/)等旗下均有多种基于STR遗传标记的法医学身份识别产品。2017年，美国FBI对法医学领域的核心STR基因座进行了扩展(https://www.fbi.gov/about-us/lab/biometric-analysis/codis/planned-process-and-timeline-for-implementation-of-additional-codis-core-loci,HaresDR,2015,Forensic Sci.Int.Genet.17:33-34.)。国内也有公司基于法医学领域常用STR基因座组合开发出不同的法医学产品并申请了相应的专利，如CN105368958A、CN103789414B、CN104017895B、CN103789414B等。在医学领域，也出现了依据STR遗传标记进行疾病诊断等的专家共识(2016，荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用协组，中华妇产科杂志，51.5：321-324)。

在各种类型的STR遗传标记中，以3-5个碱基为核心重复单元的遗传标记最为常用，前述法医学领域中各STR基因型分型试剂盒均属此类。在各STR基因分型试剂盒中，一个关键的组份是等位基因阶梯(allele ladder)，其作用在于对样本进行相应STR分型时作为STR等位基因的标准参考品。以D13S317为例，其核心重复序列为[TATC]n，其常见的核心重复次数为5-15。那么当采用某一对PCR引物对D13S317进行基因分型时，其相应的等位基因阶梯中就应该包含这些常见重复次数所对应长度的PCR扩增片段。当一个样本采用同样的PCR引物进行扩增时，扩增片段长度与等位基因阶梯的片段长度进行比对，若与核心重复次数10相应的片段长度相等，则该等位基因即命名为10。显然，对同一个STR基因座，采用不同的PCR扩增引物，同样的等位基因的扩增长度极有可能是不同的，必须依据相同的PCR引物重新制备相应的等位基因阶梯。如此，才可以确保依据不同的产品对同一个样本的等位基因命名都是一致的，使结果具有可比性。由此，可以看出STR基因座的allele ladder的制备在相应STR分型产品中的重要性。