[发明专利]一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法

说明书

本发明公开了一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法，包括：巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04‑0.06MPa、温度为40‑60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/5‑1/10后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；硅胶柱层析；凝胶柱层析；再次硅胶柱层析；硅胶减压柱层析得到芥酸酰胺。本发明底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低、培养基质容易获得。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法。

背景技术

芥酸酰胺(Erucamide)化学名称顺-13-二十二碳烯酸酰胺，是一种应用范围广泛且优良精细化工产品，可作为聚乙烯、聚丙烯的润滑剂、抗粘剂、泡沫稳定剂和防腐剂、照相感光材料、染料和颜料的分散剂等。有研究表明，芥酸酰胺可通过反硝化细菌荧光假单胞菌（Pseudomona fluorescens）刺激硝基去除，进而刺激细菌氮同化和反硝化作用，对未来生态环境治理具有重要作用。文献报道芥酸酰胺的合成方法主要有直接氨化法、酯化法、过渡金属化合物催化法、烷基化催化剂催化法、常温常压无催化法，但因生产工艺和设备条件的限制导致其很难合成，并且残留的未反应原料芥酸及其衍生物等杂质也会造成其产品质量分数低、色泽较深，从而直接影响到产品的品质和应用，降低了产品的价值和竞争力。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低、培养基质容易获得的利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法。

本发明目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明的一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法，包括以下步骤：

（1）粗提物的制备

巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04-0.06MPa、温度为40-60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/5-1/10后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；

（2）硅胶柱层析

将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与40～80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，水浴挥干乙酸乙酯后上样在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚,石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇等比例洗脱，流速为10~20 mL/min，通过薄层层析色谱分析，Rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；

（3）凝胶柱层析

浓缩液对青枯雷尔氏菌活性抑菌率为75%~85%的浓缩液，用体积比为1:1氯仿与甲醇溶液溶解后进行羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，并用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；

（4）再次硅胶柱层析

将浓缩组分再次进行硅胶层析，用氯仿:甲醇=30:1、20:1,100%甲醇进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；

（5）硅胶减压柱层析