[发明专利]用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA、表达载体、试剂盒及其用途

说明书

本发明公开了一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA，属于基因工程技术领域，所述sgRNA具有如SEQ ID NO.1‑56中的任一种核苷酸序列，本发明还公开了用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA组合物、表达载体、CRISPR/Cas9系统、试剂盒及其在制备治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物中的用途；利用本发明制备的特异性靶向人NKG2A/KLRC1基因能够精确的靶向人NKG2A/KLRC1基因并实现有效的敲除，同时，所得的人NKG2A/KLRC1基因敲除免疫细胞适用于多种肿瘤细胞模型；该制备方法步骤简单、sgRNA靶向特异性好，CRISPR/Cas9系统的敲除效率高。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA、表达载体、试剂盒及其用途。

背景技术

CRISPR/Cas系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来，CRISPR序列和其相关基因(Cas基因)共同作用，因其特有的RNA介导的核酸内切酶活性得到生物学界的广泛关注。其中，来源于Streptococcus Pyogenes为代表的II型DNA内切酶Cas9因其只有一个亚基，结构最为简单，所以应用最为广泛。CRISPR/Cas9系统通过识别特定序列的small-guide RNA(sgRNA)序列定位靶向基因，引导Cas9切割靶向序列，造成双链DNA断裂(Double-strand breaks,DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组的末端连接(Non-Homologous End Joining,NHEJ)DNA修复方式产生碱基的插入或缺失，从而造成移码突变达到基因敲除的目的。

与ZFN(Zinc Finger Nucleas)和TALEN(Transcription Activator-likeEffector Nucleas)需要研究者根据目的基因设计和植被一对特异性的核酸酶相比，CRISPR/Cas9技术能够快速高效的靶向任意一个或多个基因，并且具有操作简便，可以高通量制备以及成本低等优势。因此，这一技术在免疫细胞改造和基因临床治疗中具有很高的应用前景和价值。

CRISPR/Cas9系统中，Cas9靶向切割是依靠sgRNA识别靶序列实现的。虽然靶序列只有20个核苷酸，设计十分简便，但是非特异性结合(脱靶)的几率也相对较大。脱靶会造成出目的基因以外的基因突变，给人体带来不可预估的影响。脱靶效率对基因治疗等临床应用是不可忽视的安全隐患，也是限制该技术发展和应用的主要原因。因此，sgRNA对目的基因的特异性和靶向准确性是目的基因特异性敲除的先决条件。因此，具有高度特异性和准确性sgRNA的设计和制备是CRISPR/Cas9基因敲除的关键。

现今，在肿瘤临床治疗中，使用阻断免疫细胞表面的免疫检查点抗体进行的免疫治疗是常用的治疗手段。免疫检查点(Immune Checkpoints)是调节系统性免疫稳态与耐受的信号通路。诸多研究表明，肿瘤细胞表面高表达免疫检查点配体，通过结合免疫细胞的免疫检查点达到抑制肿瘤免疫的效果。这一效果在肿瘤抗原特异性的效应T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的肿瘤抑制中尤为突出。特定的免疫检查点的阻断，比如PD-1，能够增强抗肿瘤免疫反应。2018年，刊登在国际著名杂志Cell的最新研究表明，利用抗体阻断免疫检查点NKG2A能够促进NK细胞和效应T细胞对肿瘤的查杀能力，并且通过联合用药在临床实验中取得了很好的疗效。因此，NKG2A是继CTLA-4、PD-1/L1和IDO2之后最具有临床应用价值的肿瘤治疗靶点。

但是，利用免疫检查点抗体的治疗并非对所有癌症均有效果。PD-1抗体对黑色素瘤虽然有较好的疗效，但是仅对部分肾癌和肺癌具有效果。其他免疫检查点抗体药物也还处于临床试验阶段，比如NKG2A，目前，已经有很多采用NKG2A抗体进行肿瘤治疗的报道。但是还存在抗体药物作用的短效性、免疫检查点的多样性、药物研发时间过长、抗体价格昂贵等诸多不利因素。