[发明专利]一种水体微生物菌种分离与纯化的方法和采样装置

权利要求书

1.一种水体微生物菌种分离与纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤，

步骤1，将待分离与纯化的样品和碳酸钙溶液加入海藻酸钠溶液中得到沉淀和悬浊液，其中海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量与碳酸钙溶液中碳酸钙的质量比为(2.5～75)：(0.5～2.5)；

步骤2，向失水山梨糖醇脂肪酸酯和液体石蜡组成的油相A中加入悬浊液得到混合体系A，其中，在组成油相A时，失水山梨糖醇脂肪酸酯的体积是液体石蜡体积的0.1％～0.3％，在加入悬浊液时，悬浊液的体积与油相的体积比为1：(2～4)；

步骤3，向混合体系A中加入6～10ml的冰醋酸，在22～25℃下反应8～12min得到混合体系B，向混合体系B中加入氯化钙溶液，其中每次加入的氯化钙质量为0.004～0.01g，得到3～5mm的微胶囊，用灭菌水清洗3～5mm的微胶囊得到微胶囊菌种库；

步骤4，将微胶囊菌种库逐一接种到多孔平板中培养得到单一菌落，其中多孔平板中装有待分离与纯化菌种的BM液体培养基溶液。

2.根据权利要求1所述的一种水体微生物菌种分离与纯化的方法，其特征在于，步骤2向油相A中以300～350r/min的速率边搅拌边加入悬浊液，搅拌4～8min得到混合体系A。

3.根据权利要求1所述的一种水体微生物菌种分离与纯化的方法，其特征在于，步骤4中所述多孔平板为96孔板。

4.根据权利要求1所述的一种水体微生物菌种分离与纯化的方法，其特征在于，步骤1中所述待分离与纯化的样品通过以下步骤得到，

步骤1a，将聚乙烯醇纤维丝均匀分散到NaOH溶液中，在50～60℃下搅拌8～12h，收集NaOH溶液中的聚乙烯醇纤维丝得到改性后的聚乙烯醇纤维丝；

步骤1b，将改性后的聚乙烯醇纤维丝与待分离与纯化菌种的BM固体培养基溶液均匀混合得到混合体系C，对混合体系C高压蒸汽灭菌得到高压蒸汽灭菌后的培养基溶液；

步骤1c，将高压蒸汽灭菌后的培养基溶液在厌氧工作台中室温冷却，得到凝胶，将凝胶在-80℃下保持15～30min，之后-80℃～0℃梯度升温80～120min，得到含水量为10％～20％的培养基凝胶条，将该培养基凝胶条装入外壁设置有开口的采集装置中，得到含有培养基凝胶条的采集装置；

步骤1d，将含有培养基凝胶条的采集装置插到沉积物中36～72h，采集装置中含水量为10％～20％的培养基凝胶条在富集过程中吸水膨胀为含水凝胶，得到待分离与纯化的样品；

所述的采集装置为空心结构，由两部分组成，上半部分为圆柱，下半部分为圆锥，圆柱与圆锥接触处的直径相同，采集装置的外壁上设置有弧形的开口，开口平行于采集装置圆柱部分的横截面设置，弧长≥圆周长的70％，高度为1.2～2.5mm。

5.根据权利要求4所述的一种水体微生物菌种分离与纯化的方法，其特征在于，步骤1b按80:20的体积比例通入N₂/CO₂的混合气体对混合体系C排氧直至达到待分离与纯化菌种生存所需的标准，再进行高压蒸汽灭菌。

6.根据权利要求4所述的一种水体微生物菌种分离与纯化的方法，其特征在于，步骤1c先将高压蒸汽灭菌后的培养基溶液倒入两个半径和长度均相等的半圆形柱槽中后，在厌氧工作台中室温冷却，经-80℃保持和-80℃～0℃梯度升温得到两个相同半径和相同长度的含水量为10％～20％的培养基凝胶条，再将这两个培养基凝胶条拼成一个圆柱，将该圆柱装入采集装置中。

7.根据权利要求6所述的一种水体微生物菌种分离与纯化的方法，其特征在于，所述的圆柱先用滤膜缠绕一层，再装入采集装置中。

8.根据权利要求7所述的一种水体微生物菌种分离与纯化的方法，其特征在于，所述的滤膜为微米级规格的滤膜。