[发明专利]包被液和原代肿瘤细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种用于促进细胞贴壁的包被液，其特征在于，包括：

混合均匀的Ⅰ型胶原蛋白、包被液Ⅱ以及包被液Ⅲ，其中，所述包被液Ⅱ为10×F12培养基，所述包被液Ⅲ为40-100mM NaOH、200-300mM NaHCO₃以及100-250mM HEPES组成的混合液，所述Ⅰ型胶原蛋白、所述包被液Ⅱ以及所述包被液Ⅲ的体积比为8:1:1。

2.一种原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，包括：

将权利要求1所述的包被液均匀铺于细胞培养容器中，并将铺有包被液的细胞培养容器置于37℃细胞培养箱中1~2h，制得包被的细胞培养容器；

通过清洗液清洗肿瘤组织；

顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理；

顺次利用所述包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞；

当培养细胞的细胞汇和度达到70~90%时，基于DF10培养基，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式，纯化原代肿瘤细胞。

3.根据权利要求2所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，所述顺次利用细胞分散酶和细胞消化液对清洗后的肿瘤组织进行消化处理，包括：

在1-2ml DF培养基内，将清洗后的肿瘤组织剁成碎泥状；

将碎泥状的肿瘤组织转移至离心管中，以10-20ml DF培养基重悬后，第一次离心3~5min，移除上清；

向第一次离心后的细胞沉淀中按一定比例加入细胞分散酶和DF培养基，置于37℃ CO₂培养箱中，振荡消化20~120min，并加入DF10培养基终止消化，吹散混匀，第二次离心3~5min，移除上清；

向第二次离心后的细胞沉淀中加入3~5mL细胞消化液，吹散混匀，静置3-5min，加入10-15mL DF10培养基终止反应，吹散混匀，得到细胞液。

4.根据权利要求2或3所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，所述顺次利用所述包被的细胞培养容器和含抗生素的无血清培养基培养消化后的细胞，包括：

通过200-300µm尼龙膜对消化后得到的细胞液过滤，将过滤后的细胞液收集到离心管中，第三次离心3-5min，移除上清；

用含抗生素的DF10培养基对第三次离心后的细胞沉淀重悬；

将重悬后的细胞接种至包被的细胞培养容器中培养；

所述包被的细胞培养容器内的细胞贴壁后，将培养基换成含抗生素的无血清培养基，置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中继续培养，并每隔2~3天更换一次所述含抗生素的无血清培养基。

5.根据权利要求4所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，所述基于DF10培养基，采用胰酶差时消化法、差时贴壁法、反复贴壁法相结合的方式，纯化原代肿瘤细胞，包括：

去除所述含抗生素的无血清培养基；

用1~2ml EDTA-Trypsin消化处理；

显微镜下观察，边消化边收集肿瘤细胞，用DF10培养基终止消化，消化时间间隔为2-10min，肿瘤细胞全部消化下来后，第四次离心3~5min；

用DF10培养基对第四次离心后的肿瘤细胞重悬，将重悬后细胞放于所述包被的细胞培养容器中，并置于37℃，5%CO₂细胞培养箱中5~120min，使成纤维细胞先贴壁；

将未贴壁的原代肿瘤细胞收集起来，加入DF10培养基转入新的所述包被的细胞培养容器继续培养，反复贴壁2-6次。

6.根据权利要求2所述的原代肿瘤细胞分离培养方法，其特征在于，

所述清洗液为含有抗生素的生理盐水、含有抗生素的PBS以及含有抗生素的培养基中的任意一种或多种；

和/或，

所述细胞分散酶，包括：胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶以及弹性蛋白酶中的任意一种或多种；

和/或，

所述细胞消化液，包括：浓度为0.02%~0.05%的EGTA和浓度为0.2%~0.5%的Trypsin。