[发明专利]一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白

说明书

本发明涉及一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白。本发明系采用经过密码子优化、破伤风梭菌毒素C片段与含有多个氨基酸突变的产气荚膜梭菌β毒素突变体的重组融合蛋白，即最大限度地保留两种毒素蛋白的免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。该重组融合蛋白可用来制备破伤风梭菌、B型产气荚膜梭菌和C型产气荚膜梭菌的单位疫苗，与我国目前商品化的梭菌类天然毒素灭活疫苗相比，具有制备工艺简单、免疫剂量低、疫苗效力优良等优点，并大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是上述三种梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗抗原；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

技术领域

本发明涉及一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白。属于生物制品领域。

背景技术

破伤风梭菌和产气荚膜梭菌是能够引起人和多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大，而这两种类型的梭菌的致病因素均是菌体分泌的外毒素。破伤风梭菌只含有一种外毒素，被称为破伤风毒素(Tetanus toxin，TT)，而产气荚膜梭菌的外毒素至少有20种，但以α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)这4种外毒素最为主要，并可据此将该菌分为A，B，C，D，E 5个毒素型(Revitt-Mills,S；Rood,J；Adams,V.Clostridiumperfringens extracellular toxins and enzymes:20andcounting.Microbiol.Aust.2015,36,114–117.)。由于破伤风梭菌病和产气荚膜梭菌病均具有发病突然，死亡迅速等特点，因此，疫苗免疫是防控上述两类疾病的主要手段。目前，使用的商品化梭菌疫苗主要是灭活疫苗，如羊快疫、猝疽、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活苗以及羊梭菌病多联干粉苗。其中，破伤风主要是由破伤风毒素(TT)引起，而猝疽和羔羊痢疾主要与B和C型产气荚膜梭菌分泌的β毒素(CPB)有关。该类灭活疫苗在预防动物破伤风梭菌和产气荚膜梭菌所致疾病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的破伤风梭菌和产气荚膜梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。

破伤风毒素(TT)，全长1 315个氨基酸，相对分子质量约150kDa，由A、B和C共3个片段组成。其中，破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment，TTc)是重链的C末端，相对分子质量约为50kDa，是毒素与细胞受体的结合区域。已有研究发现，该片段在原核表达系统中可溶表达的比例较高，且具有较好的免疫原性(Wells J M,Wilson P W,Norton P M,etal.Lactococcus lactis:high-level expression of tetanus toxin fragment C andprotection against lethal challenge[J].Molecular Microbiology,2010,8(6):1155-1162.)。