[发明专利]疏血通注射液中18种氨基酸的含量测定方法

权利要求书

1.一种疏血通注射液中18种氨基酸的含量测定方法，其特征在于，采用HPLC-MS/MS法，同时测定疏血通注射液中18种氨基酸的含量；所述18种氨基酸包括：苯丙氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸，精氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸，亮氨酸，鸟氨酸，γ-氨基丁酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，组氨酸；所述方法包括：

(1)建立18种氨基酸的标准曲线；

分别精密称取苯丙氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸，精氨酸，甲硫氨酸，赖氨酸，亮氨酸，鸟氨酸，γ-氨基丁酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，组氨酸对照品，用超纯水溶解，制成具有已知浓度的各对照品储备液；

由各对照品储备液配制成具有已知浓度的18种氨基酸的混合对照品储备液；

用超纯水将所述混合对照品储备液稀释成一系列分别具有不同已知浓度的18种氨基酸的混合对照品溶液；

在相同的预设色谱条件和质谱条件下，将体积V₁的各浓度的混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，获得各浓度混合对照品溶液的提取离子流色谱图；

以各混合对照品溶液的提取离子流色谱图中各氨基酸的色谱峰峰面积为纵坐标，以各氨基酸的浓度为横坐标，分别建立各氨基酸的标准曲线；

(2)获得供试品溶液的提取离子流色谱图；

精密吸取体积V₂的疏血通注射液供试品，用超纯水稀释至体积为V₃，过滤后制得供试品溶液；

在与以上(1)步骤中相同的预设色谱条件和质谱条件下，取体积V₁供试品溶液注入高效液相色谱仪中，获得供试品溶液的提取离子流色谱图；

(3)确定供试品中18种氨基酸的含量；

根据供试品溶液提取离子流色谱图中18种氨基酸各自的色谱峰峰面积，和已建立的各氨基酸的标准曲线，分别读出18种氨基酸各自的浓度C₁，并按照下列公式分别计算出供试品中18种氨基酸的含量C；

C＝C₁×V₃/V₂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，用超纯水将所述混合对照品储备液稀释成5～10个具有不同已知浓度的18种氨基酸的混合对照品溶液，在所得的各混合对照品溶液中，天冬氨酸、甘氨酸的浓度分别为100-20000ng/mL；亮氨酸、缬氨酸的浓度分别为40-8000ng/mL；苯丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸的浓度分别为20-4000ng/mL；丝氨酸、苏氨酸的浓度分别为10-2000ng/mL；脯氨酸的浓度为7.5-1500ng/mL；甲硫氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸的浓度分别为5-1000ng/mL；色氨酸、精氨酸、组氨酸的浓度分别为2.5-500ng/mL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，V₂与V₃的比值为1：(50～150)；优选为1：100。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预设的色谱条件包括：

色谱柱：采用C18反向硅胶色谱柱；流动相：A相为0.01％-1％甲酸-水，B相为乙腈；梯度洗脱；柱温：35～45℃；流速：0.1～1mL/分钟；进样量：2.5～7.5μL。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，流动相中A相为0.05％～0.5％甲酸-水；优选为，流动相中A相为0.1％甲酸-水。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述柱温：40℃；流速：0.5mL/分钟；进样量：5μL。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：B相占流动相的体积百分比在下述范围内随着时间的增加而增加，0–8分钟，6％–50％；8–9分钟，50％–95％；9-10分钟，95-95％。